重症肌无力循环CD4

重症肌无力循环CD4重症肌无力患者的循环CD4重症肌无力循环CD4+CXCR5+FOXP3+Tfr样细胞和CD4+CXCR5+FOXP3-Tfh样细胞失衡本研究显示MG患者循环Tfr样细胞的频率显着降低，Tfh样细胞频率增加。?Tfr样/Tfh样比率与MG患者的临床严重程度呈负相关。?糖皮质激素治疗可以恢复MG患者循环Tfr样/Tfh样细胞的失重症肌无力循环CD4本文内容：重症肌无力循环CD4+CXCR5+FOXP3+Tfr样细胞和CD4+CXCR5+FOXP3-Tfh样细胞失衡本研究显示MG患者循环Tfr样细胞的频率显着降低，Tfh样细胞频率增加。?Tfr样/Tfh样比率与MG患者的临床严重程度呈负相关。?糖皮质激素治疗可以恢复MG患者循环Tfr样/Tfh样细胞的失衡。抽象卵泡调节性T（Tfr）细胞被定义为调节性T细胞（Tregs）的特定子集，其用于控制??生发中心中滤泡辅助性T（Tfh）细胞和B细胞的过度活化。越来越多的证据表明，Tfr细胞或Tfh细胞的失调导致生发中心反应异常，这些反应有助于自身免疫疾病的发病机制。然而Tfr细胞和Tfh细胞在重症肌无力（MG）中的作用仍不清楚。该研究显示，与健康对照相比，MG患者外周血中CD4+CXCR5+FOXP3+Tfr样细胞的频率显着降低，CD4+CXCR5+FOXP3-Tfh样细胞的频率增加。此外，Tfr-喜欢/Tfh样比例与MG患者的临床严重程度呈负相关。有趣的是，糖皮质激素（GC）治疗可以恢复循环Tfr样/Tfh样不平衡细胞，这种恢复伴随着临床症状的减轻。这些结果首次表明，循环Tfr样和Tfh样细胞的不平衡可能参与免疫发病机制。MG可能为MG疗法的发展提供新的见解。介绍重症肌无力（MG）是一种自身免疫性疾病通常由针对骨骼肌的乙酰胆碱受体（AChR）或肌肉特异性酪氨酸激酶（MuSK）的自身抗体引起[1]。抗原特异性CD4+T细胞对于在称为生发中心反应的多步骤过程中产生高亲和力自身抗体和长寿浆细胞至关重要，从而在MG的发病机制中发挥关键作用。CD4+T.根据细胞的独特转录因子表达，细胞因子产生和多种免疫功能，将细胞分为几个群体。卵泡辅助T（Tfh）细胞是促进生发中心B细胞发育的子集之一，可促进体细胞高变，亲和力成熟和高亲和力抗体的产生，而调节性T细胞（Tregs）可起控制作用B细胞反应并在建立自我耐受中发挥关键作用。最近，卵泡调节性T（Tfr）细胞被定义为主要位于生发中心的Tregs的特化群体。Tfr细胞与Tfh细胞具有共同的特征：两个亚型均表达CXCR5，CXCR5是通过趋化因子CXCL13的梯度将它们引导至B细胞区的受体。另外，两个亚组均表达程序性死亡1（PD-1），ICOS和B细胞淋巴瘤6（Bcl6）。然而，Tfr细胞被认为起源于胸腺来源的Treg前体可以通过FoxP3，CD25和GITR的表达与Tfh细胞区分开来。Tfr细胞可抑制生发中心B和Tfh细胞的增殖，阻止自身免疫，从而与Tfh细胞在体液免疫调节发挥相反的作用。不受控制的Tfr或Tfh活动可能导致免疫耐受失调和高水平自身抗体的异常产生，从而促进自身免疫反应的发展。到目前为止，有限的研究已经探索了潜在的作用Tfh细胞在MG发病机制中。2005年，MG患者首次发现循环CD4+CXCR5+T细胞的频率增加，并且这种增加也与疾病严重程度正相关。进一步研究证实，与健康对照相比，MG患者循环Tfh细胞（定义为CD4+CXCR5+PD-1高和CD4+CXCR5+ICOS高）的频率增加。此外，胸腺Tfh细胞的表达也与MG的临床严重程度正相关。这些研究表明，Tfh细胞参与MG的异常免疫应答。此外，Tfr细胞缺陷已在实验性自身免疫性重症肌无力（EAMG）的淋巴结（LNs）中被描述，并伴有增加的Tfh细胞。有趣的是，全反式维甲酸（ATRA）治疗可以恢复Tfr细胞之间的不平衡，LN中的Tfh细胞和T细胞的其他子集并且减弱EAMG症状。所有这些研究都表明Tfr/Tfh细胞失衡在MG发病机制中的关键作用。但是，到目前为止还没有任何报道MG患者循环Tfr细胞的频率，以及Tfr细胞的作用及其与其他T细胞亚群在MG异常免疫应答中的关系仍有待阐明。在这项研究中，我们试图调查人口在MG患者中循环Tregs（定义为CD4+CD25+FOXP3+），Tfr样细胞（定义为CD4+CXCR5+FOXP3+）和Tfh样细胞（定义为CD4+CXCR5+FOXP3-）。我们发现与健康对照相比，MG患者外周血中Treg/Tfr样细胞的频率显着降低，Tfh样细胞的频率更高。此外，Tfr样/Tfh样比率是相反的与MG患者的临床严重程度相关。最后，我们证明糖皮质激素（GC）治疗可以恢复Tfr样/Tfh样细胞的不平衡，并且这种恢复伴随着临床症状减轻。我们的结果表明循环Treg/Tfh样/Tfr样细胞群的不平衡参与MG的发病机制并提供新的指标用于评估MG患者的新疗法的免疫状态和潜在目标。2。材料和方法2.1。耐心共有79名MG患者从门诊招募2013年1月至2013年12月期间，从中南大学湘雅医院门诊招募了另外22名健康对照（HC）受试者。所有参与者在纳入研究之前签署了知情同意书。根据患者的病史和临??床表现诊断MG，包括易疲劳的肌肉无力波动，对胆碱酯酶抑制剂的阳性反应和/或反应减弱重复运动神经刺激和/或正单纤维肌电图。排除标准如下：患有其他自身免疫疾病的受试者，接受免疫抑制药物的患者，研究前的血浆置换或胸腺切除术，以及前4周的急性炎症患者。根据治疗策略将79名MG患者分为两组。（1）治疗组：20例MG患者接受糖皮质激素（GCs）治疗研究;（2）未治疗组：59名MG患者在研究前未接受GC治疗。接下来，建议13名未经治疗的患者从研究开始接受GC治疗，随访3个月。泼尼松通常以高剂量（每天0.75-1.0mg/kg）开始，然后剂量逐渐减少并维持在最低剂量需要达到最大效果（通常每天5-10毫克）很长一段时间。MG患者的临床特征表1总结了这项研究。赫尔辛基宣言的行，并得到了人类的批准中南大学湘雅医院伦理委员会，中国长沙。2.2。MG患者的临床评价我们设计了一个统一的登记表来收集详细的临床表来自MG患者的数据，并根据他们进行分类美国重症肌无力基金会的分类（MGFA）和定量重症肌无力评分（QMGs）。2.3。样品处理三毫升静脉血直接收集到含肝素的管。然后，外周血单核细胞通过密度梯度离心分离（PBMC）使用Ficoll-PaquePlus（中国天津昊阳）并进一步用pH7.2的磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次3小时2.4。流式细胞术人PBMC（1×106/管）染色并孵育在室温下避光30分钟，用5升反抗身体鸡尾酒CD4-FITC，CD25-PE/Cy7和CXCR5-APC和同种型匹配的对照IgG抗体（eBioscience，USA）。下一个，用PBS洗涤细胞两次并孵育45分钟在冰上用新鲜固定/透化溶液。洗完后用透化缓冲液两次，细胞用5μl染色PercpCy5.5-缀合的抗人FOXP3（eBioscience，USA）和同种型对照抗体并在冰上孵育50分钟。该然后通过流式细胞术分析染色的细胞。流式细胞仪设置和荧光补偿使用BDCompBeads和每个实验标准化BDFACSDivaComp程序（BDImmunocytometrySystems）。每个样品至少分析50,000个事件。FSC和SSC门设置为捕获目标细胞群，其中包括单核细胞和淋巴细胞，排除任何在关注CD4+T之前，将中性粒细胞和碎片染色细胞。随后，每个细胞群被识别并且用荧光表面标记物裂解。同种型对照是用于确定阳性细胞。阳性细胞的门允许血液CD4+细胞中0.5％的阳性同种型对照，并且所有值都在CD4+细胞上进行门控。Treg，类似Tfr，和Tfh样细胞分别定义为CD4+CD25+FOXP3+，CD4+CXCR5+FOXP3+，CD4+CXCR5+FOXP3-细胞。2.5。统计分析所有数据均表示为平均值±标准差除非另有说明，否则（SD）。使用SPSS19.0版软件，使用非配对t检验和Welch校正分析组间对之间的差异。用单向ANOVA分析三组之间的差异。使用Pearson相关系数测试评估变量对之间的关系。Treg，Tfr样百分比的变化，GC处理前后的Tfh样细胞和样品用配对t检验解析。低于0.05的P值被认为是显着的。3.结果3.1。循环Treg/Tfr样/Tfh样细胞的不平衡CD4+T.MG患者的细胞与健康供者相比在这研究，未经治疗的MG患者（n=59），GC治疗的MG招募患者（n=20）和健康受试者（n=22）。那里在年龄或性别的分布上没有显着差异两组MG患者和HC组之间的差异（表格1）。首先，从中分离出CD4+T细胞群使用中描述的门控策略的其他细胞和碎片方法部分（图1a和b）。没有显着差异在获得的PBMC中观察到CD4+T细胞的频率来自MG患者和健康对照（数据未显示）。接下来，分析循环Treg/Tfr样/Tfh样细胞的频率通过流式细胞术，代表性的点图和相关的自发同种型对照如图1c-h所示。关系到健康的捐赠者，我们发现频率明显较低周围的CD4+CD25+FOXP3+Tregs（CXCR5+加上CXCR5-）未经治疗的MG患者的血液，但未经GC处理患者（图1d，e和i）。这些结果证实了这种不平衡MG患者中循环Tregs的表现之前的学习。而且，我们发现百分比显着降低CD4+CXCR5+FOXP3+Tfr样细胞的年龄和更高的百分比CD4+CXCR5+FOXP3-Tfh样细胞在外周血中的表达未治疗的MG患者与MG患者相比经过GC治疗和健康受试者（图1g，h，j和k）。因此，Tfr样/Tfh样比率降低在未治疗的MG患者中观察到与其他患者相比两组（图1l）。总的来说，这些数据提供了证据MG中循环Treg/Tfr样/Tfh样细胞的不平衡P重症肌无力循环CD4本文关键词：循环，重症肌无力，CD4