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FunctionalanalysisofPsG6PDH,acytosolicglucose-6-phosphatedehydrogenasegenefromPopulussuaveolens,anditscontributiontocoldtoleranceimprovementintobaccoplantsPublishedbyBiotechnologyletters:21，May,2013Factor：1.853报告人：专业：生物学基地年级：2011级日期：2014年5月11号1.背景介绍2.实验方法3.结果与讨论主要内容4.实验结论5.前景展望低温是限制植物生长，发育和分布的重要环境因素之一，低温不但降低植物的生命合成活性，抑制正常的生理代谢过程，而且严重时还会导致植物死亡。低温寒害是农业、林业生产的主要自然灾害之一。背景介绍低温的危害：常规育种存在的不足：育种周期长，杂交方式单一，杂交难度大等局限性，杂交工序复杂费时，易受季节、气候、地域及水分等多种环境因素限制。甜杨(Populussuaveolens)：属杨柳科(Salicacae)，主要分布于大兴安岭北部及漠河一带，是研究木本植物抗冻性及有关抗冻基因克隆的理想材料。G6PDH(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶)：磷酸戊糖途径的关键性调控限速酶，其主要功能是为脂肪酸合成、氮还原和谷胱甘肽等生物分子合成提供还原力NADPH，也为核酸合成提供戊糖；此外，还参加非生物逆境胁迫应答反应。因此，G6PDH对植物的生长发育起着非常重要的作用。背景介绍背景介绍甜杨中分离G6PDH基因生物学分析PsG6PDH的原核表达该基因可能编码胞质PsG6PDH而且与基因胁迫有关验证了其编码框的完整性导入烟草进行表达和分析对其功能进行进一步鉴定实验部分实验部分甜杨高效稳定的离体培养体系的建立总RNA的提取基因组DNA的制备G6PDH基因的分离和克隆植物表达载体的构建和遗传转化转PsG6PDH基因烟草材料的获得低温抗性实验电导率的测定超氧化物歧化酶SOD活性的测定过氧化物岐化酶POD活性的测定丙二醛MDA含量的测定PsG6PDH在转基因烟草耐低温中的可能作用ThepredictedtertiarystructureofPsG6PDHprotein结果与讨论含有NADP结合区（红色）和G6P结合区（蓝色）两个保守功能域，具有多个磷酸化位点和跨膜区域，表明PsG6PDH可能作为膜受体而起作用系统发生树结果与讨论实验部分甜杨高效稳定的离体培养体系的建立总RNA的提取基因组DNA的制备G6PDH基因的分离和克隆植物表达载体的构建和遗传转化转PsG6PDH基因烟草材料的获得低温抗性实验电导率的测定超氧化物歧化酶SOD活性的测定过氧化物岐化酶POD活性的测定丙二醛MDA含量的测定PsG6PDH在转基因烟草耐低温中的可能作用实验部分植物表达载体的构建：PsG6PDH烟草的遗传转化：实验部分利用经典的的叶盘转化法把甜杨G6PDH基因转入烟草，经过含Kan和Cef培养基的筛选、继代和生根培养，得到一批转基因烟草。30daysold，将植株转入土壤，在植物培养箱中under15%，a16/8hlight/darkphotoperiodfor1month。Usedforcoldtoleranceassaysandgeneexpressionanalyses实验部分甜杨高效稳定的离体培养体系的建立总RNA的提取基因组DNA的制备G6PDH基因的分离和克隆植物表达载体的构建和遗传转化转PsG6PDH基因烟草材料的获得低温抗性实验电导率的测定超氧化物歧化酶SOD活性的测定过氧化物岐化酶POD活性的测定丙二醛MDA含量的测定PsG6PDH在转基因烟草耐低温中的可能作用低温抗性试验：实验部分（1）未经15℃低温驯化：培养温度直接从25℃下降到4℃，每隔12h观察烟草的表型变化(结果如图Fig.4.a)（2）经15℃低温驯化：培养温度先降至15℃后缓慢下降到-4℃，按0.5℃/h逐步降低温度，在每处理温度下24h，观察烟草的表型变化(结果如图Fig.4.b)取生长性状一致的野生型和转基因烟草(a).Withoutcold-acclimation结果与讨论低温抗性试验：实验部分（1）未经15℃低温驯化：培养温度直接从25℃下降到4℃，每隔12h观察烟草的表型变化(结果如图Fig.4.a)（2）经15℃低温驯化：培养温度先降至15℃后缓慢下降到-4℃，按0.5℃/h逐步降低温度，在每处理温度下24h，观察烟草的表型变化(结果如图Fig.4.b)取生长性状一致的野生型和转基因烟草(b).Withclod-acclimation结果与讨论结果与讨论TransgenictobaccolinescarryingpoplarPsG6PDHexhibitedagreatercoldtolerancethanWTplants实验部分电导率的测定：取生长性状一致的野生型和转基因烟草，在25℃、4℃、0℃、-2℃、-4℃五个不同温度下分别处理两小时，选择相同位置的叶片，用0.5mm的打孔器打孔，选择10个小圆片置于试管中，加入5ml去离子水，抽真空20min后，静置一小时，用电导仪测定电导值S1。将样品沸水浴30min，静置一小时，测定电导值S2.电解质渗透率（EL）=S1/S2结果与讨论Blow0℃,ELofbothtransgeniclineswassignificantlowerthanthatofWTA.variationofelectricalconductivityoftobaccoleaveaafterserialtreatmentsat25,4,0,-2,-4℃,respectively实验部分SOD活性的测定：NBT光化学还原法G6PDH活性的测定：荧光光学法POD活性的测定：愈创木酚法MDA含量的测定：TBA（硫代巴比妥酸）反应法结果与讨论MDAPODSODG6PDHover-expressing结果与讨论IncreasedcytosolicG6PDHactivityisinvolvedinPODandSODactivityandinductionoffrezzingresistanceinpoplarcuttings.甜杨G6PDH基因在烟草中的表达，有助于膜保护性酶POD和SOD活性的提高及细胞膜的稳定，进而提高了转基因烟草的耐低温能力。实验部分Increasedtranscriptionofcold-stressrelatedgenesintobaccoplantsover-expressingPsG6PDHUp-regulated结论甜杨PsG6PDH的组成性表达，不会影响烟草的表型生长，而且在低温胁迫下可以提高烟草的抗寒能力。因此，可作为植物抗寒冻遗传改良的新的外源基因。前景展望1.由于植物抗寒冻性状受多基因控制，因此有必要从多基因的作用层次上来探讨植物抗寒冻的作用机制。2.采用生物信息学技术设计甜杨G6PDH基因的突变体，研究G6PDH突变体及其活性，以及在转基因植物中的抗性作用。经过改造可能会获得活性更强的G6PDH。感谢大家的聆听！