高效液相色谱检测微生物细胞醌类组分的技术规程

高效液相色谱(HPLC)检测微生物细胞醌类组分的技术规程起草单位：中国典型培养物保藏中心目次前言...........................................................................................................................................31.范围...................................................................................................................................42.术语与定义...............................................................................................................................42.1.菌体真空冷冻干燥（freeze-drying）.....................................................................42.2.高效液相色谱（HPLC）.........................................................................................42.3.旋转蒸发...................................................................................................................42.4保留时间Ret.Time(RT)...............................................................................................43.方法和条件...............................................................................................................................43.1.试剂...........................................................................................................................43.2.主要仪器与器材.......................................................................................................44.醌样品的制备...........................................................................................................................44.1收集菌体............................................................................................................................44.2破壁....................................................................................................................................44.3旋转蒸发.......................................................................................................................44.4纯化...............................................................................................................................55.高效液相色谱(HPLC)测定醌类组分......................................................................................55.1.准备工作...................................................................................................................55.2色谱条件............................................................................................................................55.3结果分析.......................................................................................................................5参考文献...........................................................................................................................................6前言醌是微生物化学分类指征之一，它是原核生物原生质膜上的组份，在电子传递和氧化磷酸化中起重要作用。醌主要有两种类型:甲基萘醌和泛醌。在革兰氏阳性细菌和放线菌中主要合成甲基萘醌。醌类组分中异戊二烯侧链的长度和氢的饱和度有重要的分类学意义。每种细菌都有一个主要的醌类组分，一个微生物群体中醌类种类和数量的不同反映了群体组成的多样性，醌类谱已经作为细菌群体组成多样性的一个指标，在环境微生物中广泛使用。高效液相色谱测定醌类更快速，灵敏度高，操作简单，是一种醌类组分测定的理想方法。制定本规程的目的在于提供了一种原核生物中醌类提取与HPLC检测的有效技术。本规程由武汉大学中国典型培养物保藏中心起草承担。高效液相色谱(HPLC)检测微生物细胞醌类组分的技术规程1.范围本规程规定了高效液相色谱(HPLC)检测微生物细胞醌类组分的技术规程，本规程主要适用于细菌等原核生物醌类组分的检测。2.术语与定义下列术语和定义适用于本规程2.1.菌体真空冷冻干燥（freeze-drying）指将欲干燥的菌种细胞或孢子，经预冻后在真空条件下使水分升华。2.2.高效液相色谱（HPLC）高效液相色谱用高压输液泵将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，经进样阀注入待测样品，由流动相带入柱内，在柱内各成分被分离后，依次进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。2.3.旋转蒸发在减压条件下连续蒸馏大量易挥发性溶剂，尤其对萃取液的浓缩和色谱分离时的接收，可以分离和纯化反应产物。2.4保留时间Ret.Time(RT)是指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需的时间，等于组分在流动相中停留的时间加在固定相中所停留的时间。3.方法和条件3.1.试剂醌提取试剂：氯仿；甲醇；丙酮；苯；GF254硅胶板(青岛海洋化工厂分厂，100×200mm)；试剂均为分析纯。HPLC检测试剂：甲醇（色谱纯）；异丙醇（色谱纯）；超纯水3.2.主要仪器与器材高效液相色谱仪；旋转蒸发仪4.醌样品的制备4.1收集菌体菌体摇瓶培养，通过离心收集菌体，蒸馏水洗涤两次，离心后真空冷冻干燥，如果暂时不进行制备，菌粉可以于4ºC保存备用。4.2破壁取冻干菌体约100mg，加入氯仿:甲醇(2:1；v/v)的溶液40mL，在黑暗处磁力搅拌10h左右。4.3旋转蒸发在黑暗处用滤纸过滤收集滤液，用减压旋转薄膜蒸发仪40℃减压蒸馏至干燥。用少量(1mL)丙酮重新溶解干燥物，长条状点样于GF254硅胶板上(青岛海洋化工厂分厂，100×200mm)，硅胶板最好在65℃活化半个小时左右。同时在一端点VK做对照。4.4纯化⑴以苯作展层剂，展层约20min。取出风干后在254nm紫外灯下观察。Rf=0.8，在绿色萤光背景下呈暗褐色的带即为甲基萘醌的位置，与VK位点齐平，若Rf=0.4-0.5的位置有暗褐色的带则为泛醌组分。(注意不能在紫外灯下长时间照射，以免醌降解)。⑵刮下显色的条带，用1mL丙酮溶解，然后用细菌滤器过滤除去硅胶，收集滤液(可适当浓缩至200µL～300µL),即得醌类组分的丙酮溶液。置于4℃,黑暗处保存。5.高效液相色谱(HPLC)测定醌类组分5.1.准备工作5.1.1溶剂的准备正确准备溶剂对于高效液相色谱(HPLC)试验是非常重要的，它能有效地避免鬼峰、降低基线噪声，从而提高分析能力。HPLC试验均应使用高纯度的溶剂，HPLC级纯度的溶剂比分析级(AR)溶剂的纯度更高，选择色谱级的甲醇与异丙醇作为流动相。要保证配制流动相用水的纯度足够高，用超纯水或从商店购买的纯净水。5.1.2过滤理想情况下，所有溶剂都要通过0．45µm滤膜过滤后再使用，这样能够有效防止由于微粒存在导致流路管线堵塞、过滤后应把溶剂放在密封容器中，以防止被重新污染。过滤后的溶剂既可用于色谱分析，也可用于清洗诸如泵头、柱塞朴、单向和密封圈等仪器部件，，最大程度地清洗好这些部件能保证系统性能良好。5.1.3脱气在流动相进入HPLC系统之前应首先脱气。没有脱气的流动相进入到高压系统产生的气泡会导致系统不稳、出现鬼峰等问题。从溶液中排除气泡的方法主要有：氦气脱气、超声波脱气和真空脱气。氦气或其他低溶解度气体足脱气的有效方法；在线连续脱气可以防止空气重新溶解在溶剂中。5.2色谱条件分析柱：C18(ODS5µm,250×4.6mmid)；流动相：甲醇:异丙醇(2:1；v/v)；流速：1.00mL/min；柱温：40ºC；检测波长：240nm和270nm进样量：10µL5.3结果分析在上述色谱条件下对已制备好的醌的丙酮溶液进行检测，将待测定的醌类样品与标准品图谱对照，从而确定微生物中各个醌类组分。以菌株2622的醌型图谱分析如下：No.Ret.TimePeakNameHeightAreaRel.AreaAmountTypeminmAUmAU*min%111.51MK-6136.12030.27523.89n.a.BMB*^214.70MK-7282.87872.81057.45n.a.BMB*319.62Q-1075.68023.64118.66n.a.BMB*Total:494.679126.727100.000.000经由高效气相色谱分析，菌株2622细胞中提取醌类组分有三种，保留时间Ret.Time(RT)为11.5min左右，与MK-6的保留时间一致。保留时间为14.7min左右，为MK-7,保留时间为19.62min，为Q-10。其中，菌株2622醌类组分以MK-7为主，占总醌的57.45%，另外两种比较多的醌类组分Q-10占18.66%，MK-6占23.89%。参考文献[1]东秀珠﹑蔡妙生。常见细菌系统鉴定手册，2001，第二版，科学出版社，350～419。[2]郭春雷﹑彭谦。高温菌研究进展。生物学杂志，2003，20(4)，1～3。