代谢工程概述

代谢工程(MetabolicEngineering)2第一节代谢工程概述现代生物技术手段主要包括：•基因工程(GeneEngineering)•细胞工程(CellEngineering)•发酵工程(FermentationEngineering)•酶工程(EnzymeEngineering)•现代生物技术在化工、医药卫生、农林牧渔、轻工食品、能源和环境等领域都将发挥重要作用，可促进传统产业的改造和新型产业的形成，对人类社会产生深远影响。其中发酵工程是生物技术的重要组成部分，是生物技术转化成产品的重要环节。•20世纪90年代提出的代谢工程发展迅速，被视为继传统的蛋白质多肽单基因表达（第一代基因工程）、基因定向突变（第二代基因工程）之后的第三代基因工程。代谢工程的产生•微生物发酵已经有几千年的历史，早在2000多年以前，人们就开始利用微生物进行白酒、黄酒、葡萄酒、啤酒和清酒等的发酵，此时的发酵被称为天然发酵时代。•20世纪40年代，随着抗生素青霉素的发酵生产的大规模进行，开始了现代发酵工业时代。通过自然选择的方法，人们用10-6的突变几率来筛选所谓的高产菌株。由于没有代谢控制发酵理论作为指导，直到20世纪60年代现代发酵工业仍处于盲目阶段。•1956年，日本木下祝朗博士等从东京上野动物园鸟粪中分离筛选到谷氨酸产生菌，1957年日本协和发酵公司成功地进行谷氨酸发酵，这是整个氨基酸发酵的开始，继而迅速掀起了一股氨基酸发酵研究的热潮。随着对代谢发酵理论的深入研究，转向发酵菌株本身的研究，获得了很多的氨基酸高产菌株。•随后，核酸类物质发酵产生菌也以代谢控制发酵理论为指导进行选育，并奋起直追成为后起之秀。5家有味之素,白水变鸡汁日本东京帝国大学的教授池田菊苗，1909年中国，味精，吴蕴初，1923年•氨基酸和核苷酸发酵的研究进一步推动了抗生素发酵的研究与生产，发酵由野生型发酵向高度人为控制的发酵转移；由依赖于微生物分解代谢的发酵转向依赖于生物合成的发酵，即向代谢产物大量积累的方向转移。•代谢控制发酵就是利用遗传学的方法或生物化学方法，人为地在DNA分子水平上改变和控制微生物的代谢，使得目的产物大量的生成、积累的发酵。•代谢控制发酵的核心：解除微生物代谢控制机制，打破微生物正常的代谢调节，人为地控制微生物的代谢。•随着代谢控制发酵理论的逐渐完善，目前已发展出一个重要的研究分支——代谢工程。•它是近年来分子生物学、生物化学、化学工程学和计算机科学的发展与交叉的产物，从而使生物技术突飞猛进的发展，使有关的研究进入了细胞水平。从细胞的代谢途径出发，运用工程学原理进行代谢调控，使之向产物积累的方向发展，由此创建了一个新兴的领域，即“代谢工程”。•代谢工程的理论首先由JayBailey于1991年在“Science”杂志上论述了代谢工程的应用、潜力和设计。•同年，GregStephanopoulos和JosephVallino在“Science”杂志上论述了有关“过量生产代谢产物时的代谢工程”、“代谢网络的刚性、代谢流的分配、关键分叉点及速度限制步骤”等内容。•代谢工程也被称为“途径工程”，是基因工程的重要分支。•随着DNA重组技术的日趋成熟，代谢工程的理论和应用得到了发展。代谢工程定义的演变过程如下：•（1）1988年MacQuitty指出，微生物途径工程(MicrobialPathwayengineering)是利用DNA重组技术修饰各种代谢途径（包括生物体非固有的代谢途径），提高特定代谢物的产量。•（2）1991年Bailey将代谢工程(Metabolicengineering)定义为：利用DNA重组技术优化细胞的酶活、转运和调控功能，提高细胞活力。•（3）1991年Tong等将代谢途径工程(Metabolicpathwayengineering)定义：生化途径的修饰、设计与构建。•（4）1993年Cameron认为，代谢工程(MetabolicEngineering)是利用DNA重组技术对代谢进行目的性修饰。•（5）1994年Pieperberg认为代谢工程/途径工程(Pathwayengineering/Metabolicdesign)是改造细胞代谢途径，提高天然最终产物产量或合成新产物包括中间产物或修饰型最终产物。•（6）1994年Gregory将代谢工程(MetabolicEngineering)定义：代谢工程是对生化反应的代谢网络进行目的性修饰。•（7）1996年William将代谢工程(MetabolicEngineering)定义：为达到所需目的，对活细胞的代谢途径进行修饰。•（8）1999年Koffasl将代谢工程(MetabolicEngineering)定义：利用分子生物学原理系统分析代谢途径，设计合理的遗传修饰战略从而优化细胞生物学特性。•代谢工程较系统的定义应用重组DNA技术和应用分析生物学相关的遗传学手段进行有精确目标的遗传操作，改变酶的功能或输送体系的功能，甚至产能系统的功能，以改进细胞某些方面的代谢活性的整套操作工作（包括代谢分析、代谢设计、遗传操作、目的代谢活性的实现）。简而言之，代谢工程是生物化学反应代谢网络有目的的修饰。代谢工程要解决的主要问题就是改变某些途径中的碳架物质流量或改变碳架物质流在不同途径中的流量分布。其目标就是修饰初级代谢，将碳架物质流导入目的产物的载流途径以获得产物的最大转化率。代谢工程的主要特征就是利用DNA重组技术，重建代谢网络，改变代谢流及分支代谢速度，以改进代谢产物及蛋白类产品，由于外源DNA的引入扩展了固有的代谢途径，获得了新的化学物质。改变转化蛋白的过程，减少不必要的废物。例如，谷氨酸发酵代谢工程的研究内容1、代谢流的定量和定向（1）流量评计原理A基于模型动力学B控制理论C示踪实验（2）代谢流的定向A利用环境控制B改变细胞组成的控制C代谢流向的目标产物的增加2、细胞对底物的吸收和产品的释放模型及分析（1）转运过程的生物化学A转运蛋白机制：载体通道泵B转运动力学C载体媒介转运的能量方面：偶联的概念D细胞转运活性的调节（2）研究方法方面A转运过程的实验分析B扩散和载体媒介转运间的区别C转运过程动力学分析D生物过程中的转运分析3、研究胞内代谢物浓度的反应工程方法（1）用于胞内核磁共振研究的反应工程（2）胞内代谢物分析快速反应取样的反应工程4、用13C标记实验进行胞内稳态流分析（1）稳态流分析（2）测定稳态胞内数据（3）代谢物13C标记系统的模型（4）模拟和数据分析（5）稳态标记系统的综合分析代谢工程的研究手段1、采用遗传学手段的遗传操作（1）基因工程技术的应用（2）常规诱变技术的应用2、生物合成途径的代谢调控（1）生物合成中间产物的定量生物测定（2）共合成法在生物合成中的应用（3）酶的诱导合成和分解代谢产物阻遏3、研究生物合成机制的常用方法（1）刺激实验法（2）同位素示踪法（3）洗涤菌丝悬浮法（4）无细胞抽提法（5）遗传特性诱变法•刺激实验法：在发酵培养基中，加入某些可能是前体的物质，观察该物质在发酵过程中的被利用情况与促进目的产物生成的效果。•洗涤菌丝法（或称静息细胞法）：取不同生长阶段的菌丝，先洗去沾染的原培养基成分及代谢产物，然后将菌丝悬浮于人工培养系统内，在一定条件下继续观察被试验的化合物对菌体代谢和对产物合成的影响。•无细胞抽提法：用适当的方法从细胞中分离纯化制得纯酶。将制得的纯酶和有关物质加入到反应体系、进行酶促反应，检测反应体系中的底物和产物浓度，判断该酶是否催化目的产物的生物合成。具体来讲，代谢工程的研究方法如下：•1、分子生物学方法：构建特殊的基因转移系统，尤其对于具有较高生产价值的微生物，具有重要意义。例如Backman等利用切割载体获得酪氨酸(Tyr)营养缺陷型，为构建苯丙氨酸的生产菌株奠定基础。•2、分析化学及检测方法：代谢工程的研究对象是代谢途径，因此必须对代谢通路中的一些酶及产物进行研究和分析。传统的分析通路阻断的手段有：物质平衡、同位素标记、分析障碍突变体等，目前它们仍然是必不可少的手段，而核磁共振、流式细胞术的应用则为这一领域的发展增添了新的活力。•3、数学及计算机工具：研究代谢工程不仅需要遗传学知识，而且需要对寄主菌的生化代谢途径和生理学有深入的理解，所以将DNA数据库的信息应用于代谢工程并开发出适合的软件系统是十分必要的，Karp等构建了981个生命体化合物数据库，为未来的发展奠定了基础。人们已在实验的基础上结合数学和化学的理论，发展了一些人工智能程序。KEGG数据库•代谢工程的三个基本观点•在生物工程受到广泛重视的今天，有必要把微生物(菌种选育)、微生物学过程(发酵工艺)和微生物学体系(生物反应器)作为一个整体，在科学的水平上对工业发酵进行重新审视。•从工业发酵的现状出发，主要根据对碳元素代谢及其控制，菌种是化能异养型微生物，产物是微生物细胞排出细胞的代谢中间产物的工业发酵，提出了3个基本观点。•1.生物能支撑观点•微生物细胞是工业发酵产物的生产者，微生物细胞的生长和维持需要由其自身的能量转换机构或从其他形式的能量转化形成的生物能来支撑。因此，工业发酵具有生物学属性。•2.代谢网络观点•由生化反应网络和跨输送步骤组成的代谢网络既没有绝对的起点，也没有绝对的终点。代谢网络中任何一种中间产物(或可借助生物学、化学方法与代谢网络联网的任何一种化合物)都可能被开发成为工业发酵的目的产物或原料。•3.细胞经济观点•微生物细胞的经济性是在自然选择的过程中逐渐形成的。野生的(未经人工变异的)微生物细胞在自然选择的过程中逐渐形成竞争型的细胞经济。•而工业发酵往往要以目的产物的生产为主导，调整代谢网络中的代谢流，构建一种导向型细胞经济。从竞争型细胞经济的转变取决于遗传和环境因素的信息导向，这种导向必须遵循细胞经济的基本运行规律。第二节代谢工程的基本理论一、基本概念二、代谢物流及其相关特性三、代谢网络及网络分析向心途径中心代谢途径离心途径碳架物质从向心板块注入中心板块时所流经的代谢途径统称向心途径。在工业发酵生产中，培养器中的微生物细胞的代谢是分步进行的。胞外营养物质(一般要经胞外酶降解后)从培养介质跨膜进入细胞，(一般要)经过“向心途径”、“中心途径”和“离心途径”等连续的代谢途径的代谢，才能在胞内生成目的产物，最后，目的产物跨过细胞质膜排出细胞回到培养介质中。1、胞外酶对原料的降解及营养物质进入细胞的过程2、经胞内降解代谢途径汇入中心代谢途径3、中心代谢途径及其控制4、合成代谢流及其控制5、目的产物的跨膜及其控制典型的理想载流途径应该由以上五段承担不同代谢分工的依次衔接的代谢途径组成。这就是载流途径的“五段式”。在这条载流途径上流动的代谢主流对应地也有五段，这就是代谢主流的“五段式”。一、基本概念1）底物培养基中存在的化合物，是能被细胞进一步代谢或直接构成细胞组分。碳源、氮源、能源以及能满足细胞功能必须的各种矿物元素均属于细胞代谢的底物。葡萄糖作为细胞生长的主要碳源，是最常见的底物。2）代谢产物由细胞合成并分泌到细胞外培养基中的化合物，可以是初级代谢产物（如二氧化碳、乙醇等），也可以是次级代谢产物或蛋白质。3）生物基质要素构成生物基质大分子池的一类物质，包括RNA、DNA、蛋白质、脂质和碳水化合物等。4）胞内代谢物是细胞内其他化合物，包括不同代谢途径的中间代谢物和用于大分子合成的结构单元等。5）途径是指催化总的代谢物的转化、信息传递和其他细胞功能的酶促反应的集合6）生化反应途径和代谢途径一系列按序进行的生物化学反应途径。若这条途径在活细胞里运行，则为代谢途径。葡萄糖磷酸烯醇式丙酮酸乳酸丙酮酸乳酸脱氢酶+2H7）生化反应网络生化反应途径按生物化学规律汇成生化反应网络。8）代谢网络分解代谢途径、合成代谢途径和膜输送体系的有序组合构成代谢网络。广义的代谢网络包括物质代谢网络和能量代谢网络。代谢网络的组成取决于微生物的遗传特性和微生物细胞存在的环境。葡萄糖琥珀酸草酰乙酸磷酸烯醇式丙酮酸乳酸丙酮酸乙醛乙酰Co