浙江大学生物化学实验甲-li-2009-秋冬-酵母蔗糖酶的纯化和性质分析总结

离子交换分离酵母蔗糖酶一、蔗糖酶的纯化1、酵母细胞破碎称取干酵母粉15g，石英砂约5g，放入研钵中直接研磨约5分钟，取50mlpH7.320mmol/L的Tris-HCl，分5-6次加入研砵中，边加边研磨，用力研磨20分钟后，将糊状液体转移到2支50ml离心管中，平衡后，于4℃、12000rpm离心15分钟，收集上清，量体积V1（FI），留1ml上清（FI）放置－20℃冰箱保存，用于测定蔗糖酶活力、蛋白含量和SDS-PAGE分析。2、热处理将上一步抽提液（FI），迅速放入50℃水浴中，保温30分钟，其间用玻棒经常搅动，保温结束后迅速用冰浴冷却3分钟，平衡，4℃，12000rpm离心10分钟，收集上清，量体积V2（FⅡ），留1ml上清（FⅡ）放置－20℃冰箱保存以备测定。3、有机溶剂（乙醇）沉淀将上清置于一烧杯中，加入等体积－20℃预冷的95%乙醇,冰浴中进行，慢慢滴加，边加边用玻棒轻轻搅拌均匀，注意控制在8分钟左右加完，再在冰中放置20分钟，然后转移至50ml离心管中，平衡，4℃，12000rpm离心10分钟，弃上清，沉淀置于－20℃冰箱保存，以备用于下次实验——离子交换柱层析法分离纯化蔗糖酶及测定。4、DEAE-Sepharose分离纯化蔗糖酶⑴、样品处理：将乙醇沉淀样品溶解于8-10mlpH7.320mmol/L的Tris-HCl中，4℃10000rpm离心10分钟，收集上清，量体积V3（FⅢ），取4.5ml（FⅢ）作离子交换柱层析进一步分离纯化蔗糖酶(可先做酶活性检测，取100ul酶液，经测酶活力很高，棕黑色）。其余置于－20℃冰箱保存用于测定。⑵、柱层析离子交换剂：DEAE-Sepharose，层析柱（φ1.0×20㎝），洗脱液梯度：含0-0.5mol/LNaCl的pH7.320mmol/L的Tris-HCl，流速4ml/10min，收集：管/10min（收集到样品出完为止）。上样量：4.5mlFⅢ⑶、过柱液（FⅣ）活性的粗测试剂空白F3F4（多管）pH4.6乙酸缓冲液（ml）1.51.41.4酶液（原液，ml）00.10.150℃预热5min5%蔗糖（已50℃预热，ml）0.50.50.550℃反应8minDNS（ml）111混匀，于100℃保温5min，取出，比较颜色深浅颜色强度⑷、过柱液（FⅣ）OD280的测定二、蔗糖酶的测定1、各步纯化步骤蛋白浓度的测定⑴、蛋白质标准曲线的制作管号项目012345蛋白质含量（μg）50100150200250蛋白质标准液（ml）0.20.40.60.81.0无离子水（ml）1.00.80.60.40.2Follin酚甲液（ml）5.05.05.05.05.05.0充分混匀，于（20~25℃）放置10分钟Follin酚乙液（ml）0.50.50.50.50.50.5充分混匀，于（20~25℃）放置15分钟OD640（nm）标准蛋白质液浓度：250ug/ml⑵、各步纯化步骤蛋白浓度的测定试管号项目空白Ⅰ（×10）Ⅱ（×5）Ⅲ（×2）Ⅳ（原液）012345678稀释酶液（ml）00.10.20.10.20.10.20.10.2无离子水（ml）1.00.90.80.90.80.90.80.90.8Follin酚甲液（ml）5.05.05.05.05.05.05.05.05.0充分混匀，于（20~25℃）放置10分钟Follin酚乙液（ml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.5充分混匀，于（20~25℃）放置15分钟OD640（nm）蛋白含量（mg）平均值（mg，0.1ml酶液）2、各步纯化步骤酶活力的测定⑴、葡萄糖标准曲线的制作试管号项目01234568含糖量（mg）葡萄糖标准液（ml）0.10.20.30.40.50.60.7无离子水（ml）2.01.91.81.71.61.51.41.3DNS试剂（ml）11111111混匀，于100℃水浴中保温5分钟，取出经流动水冷却后，再加4ml蒸馏水，混匀。以0号管为对照，测定各管的OD540值。OD540葡萄糖标准液浓度：1mg/ml。⑵、各步纯化步骤酶活力的测定试管号项目（ml空白Ⅰ（×40）Ⅱ（×40）Ⅲ（×20）Ⅳ（×10，多管）012345678pH4.6乙酸缓冲液（ml）1.51.41.31.41.31.41.31.41.3稀释酶液（ml）00.10.20.10.20.10.20.10.250℃预热10min5%蔗糖溶液（已预热，ml）0.50.50.50.50.50.50.50.50.5于50℃准确反应8分钟DNS试剂（ml）11111111混匀，于100℃水浴中保温5分钟，取出经流动水冷却后，再加4ml蒸馏水，混匀。以0号管为对照，测定各管的OD540值。OD540还原糖含量（mg）平均值（mg，0.1ml酶液）酶活力（U，0.1ml酶液）蔗糖酶活力单位（U）：在一定条件下，每分钟能产生1mg还原糖的酶量三、制备过程中的有关数据项目Fraction体积（ml）总蛋白含量(mg)总活力（U）比活力(U/mg)纯化倍数回收率Ⅰ1100ⅡⅢⅣ纯化倍数=FⅡ（或FⅢ，或FⅣ）的比活力FⅠ的比活力回收率=FⅡ（或FⅢ，或FⅣ）的总活力FⅠ的总活力