电化学石英晶体微天平研究界面电场对DNA杂交的影响

物理化学学报丁一‘,,一‘电化学石英晶体微天平研究界面电场对杂交的影响梁金玲周剑章’陈巧琳林玲玲林仲华厦门大学化学系,固体表面物理化学国家重点实验室,福建厦门!!摘要采用电化学石英晶体微天平,现场监测不同界面电场下完全匹配的靶标和不完全匹配的靶标分别与寡聚核昔酸探针分子杂交的过程结果表明,电极表面荷正电时表观杂交效率比电极表面荷负电时高,但假阳性比较显著而电极表面荷负电时能有效地抑制错配杂交探讨了引人界面电场后探针分子取向和微观作用力对杂交的影响关键词电化学石英晶体微天平杂交界面电场假阳性中图分类号!∀#∃一!∀#∃一‘!一!一!∀#一加柳咖,尽,却,石反厂匆加,而毗而!!!!∀#∃%&∃%∃%∃%&∀!%∃∋∀()∃∀&∃%∗+,−∃%&).∋)−#∀/)&∀)0“falsepositives”m盯beobtainedatthepositivepotential.ApplieationofnegativePotentialeanavailablyhalthybridizationfor而smatchedtargetDNA.TheeffectoftheorientationofoligonueleotideProbeandhaeroforcesonDNAhybridizationunderinterfaceeleetriefieldwasdiseussed.KeyWord:Eleetroehe而ealqualtzerystalnuerobalanee(EQCM):DNAhybridization:Interfaeeeleetricfield:FalsePositives由于基因检测和临床医学诊断的需要,基因传感器和基因芯片的研究引起了广大科研工作者的关注.基因传感器研究的基础是修饰在固体表面上DNA探针分子与溶液中靶标DNA的杂交.由于粒子一界面相互作用,界面浓度梯度及位阻现象等原因,这种固一液相界面反应与溶液相中同样的反应相比,热力学及动力学性质有很大不同.传感器表面的DNA杂交与检测的最优化条件往往是有冲突的(尤其是在电化学基因传感器中)0]:(l)强吸附有利于DNA探针分子在传感器表面的固定,有利于增大检测信号,但强吸附的同时可能会加剧非特异性吸附,从而降低DNA杂交的特异性及阻碍杂交的进行;(2)为了降低检测限传感器的面积应尽可能小,但为了更容易捕获靶标DNA,又需要面积相对大的传感器.在前人的工作卜141中,为了减少探针分子与固体表面的非特异性吸附,一般采用在传感器表面组装探针分子后,再修饰烷基硫醇的方法.但这种方法也不能完全除去非特异性吸附,而且组装烷基硫醇后,降低Reeeived:APrilZ(),2007:Revised:May21,20()7:PublishedonWeb:几ly6,20()7.*CorresPondingauthorEmail:[e-mail],en;Te汗ax:+肠592一2189663.国家自然科学基金(20423002)资助项目¾Editori沮。报eeofActaphysieo一Chi而eaSiniea尸内夕s一Chim.Sin.,2口口7Vol.23了传感器表面探针分子的覆盖度,不利于提高DNA检测的灵敏度.Heaton等‘习采用表面等离子共振(SPR)光谱技术,研究了界面电场对DNA杂交和变性的影响.通过控制正的电极电位富集带负电荷的靶标DNA,此时杂交效率较高,但容易发生错配杂交(假阳性);控制较负的电极电位排斥靶标DNA,使探针分子基本上不能杂交,还能在几分钟内使大部分错配杂交的DNA解链.他们认为,界面电场主要通过电极与靶标DNA之间的库仑力来影响DNA杂交.我们’15叹寸自组装DNA的电化学现场表面增强拉曼光谱(SERS)研究表明,DNA在电极表面形成双螺旋时,以B型构象存在,且可以通过控制界面电场使DNA探针分子在电极表面的吸附取向在垂直一斜插一平躺之间有规律地变化,认为引入界面电场后,探针分子的取向变化也会影响到DNA的杂交过程.本研究采用电化学石英晶体微天平(EQCM),现场监测不同界面电场下完全匹配的靶标DNA和不完全匹配的靶标DNA分别与探针分子杂交过程,研究施加界面电场对DNA杂交过程的影响.缓冲溶液(10mmol·L一‘Tris社mol·L一,NaCI,PH=7.4,以下所提及的Tris杂交缓冲溶液均为这个配比)并稀释至。(DNAtarget)为16林mol·L一‘.其他试剂均为分析纯.实验所需的水溶液均经MilliporeMilli一Q(〕18M仆cm)超纯水净化系统过滤后的超纯水配制.1.2电位的选择由工作电极在TriS杂交缓冲溶液中的循环伏安图可得其理想极化区为一200mv一十400mV.在这一电位区间内,电极表面不发生氧化还原反应,无法拉第电流影响DNA杂交.修饰了Hs一ssDNA的电极在TriS杂交缓冲溶液中的零荷电位为+100n1V.在本实验中,选取+350mV和一100mV作为研究电位,使电极表面分别荷正电和荷负电.1.3探针分子自组装单层的制备及组装量的测量工作电极先用0.1mol·L一,玩50、溶液进行电化学清洗后,用超纯水冲洗,真空抽干30而n.另取一石英晶振金电极作参考电极,分别测量工作电极和参考电极的频率及相应的导纳,然后在工作电极表面滴加30林L经过二硫苏糖醇(DTT)处理的Hs一55-DNA溶液1161,室温下自组装2h.用超纯水浸洗工作电极,除去未组装的探针分子.真空抽干30而n后,分别测量工作电极或参考电极的频率和导纳.石英晶振电极的频率变化不但与电极表面的质量变化有关,干态下电极频率还与导纳成线性关系.根据工作电极和参考电极各自的工作曲线(图l)进行计算,比较导纳相同时的频率变化,再扣除参考电极在工作电极组装探针分子期间由于系统误差引起的频率变化,得到工作电极在探针分子自组装后下降的频率由该频率可通过Sauerbrey阴方程和公式(l)计算探针分子在电极表面的覆盖度(0),矢鱿茎区巡(iJ〕2茎坦翌材砷xA(l)一上re化reneeelectrode3300360039004200yZs电极的频率仍与导纳(玛的关系曲线”…耐!”l弓匕30()0即N二芝”火1实验部分1.1仪器和试剂现场EQCM检测系统由Model263恒电位仪(EG&GPAR)和QCA一917石英晶体微天平(perkinElme:xnstruments)组成;电解池由三电极系统组成:AT一cut石英晶振电极(双面镀金,9MHz,金电极的几何面积是0.196cmZ,质量灵敏度为1.07ng·Hz勺为工作电极,铂电极为对电极,饱和甘汞电极为参比电极(本文中电位均相对于饱和甘汞电极的电位).由31个碱基组成的寡聚核普酸均由上海生物工程技术服务公司(sangon)提供,使用前没有进一步纯化,DNA探针分子(HS一ssDNA)碱基顺序为5’-HS一(CH公二GTAAAACGACGGCCAGTTArrAACTA-TccTA一3‘(摩尔质量为94519·mol一勺,将其分别溶于三经甲基氨基甲烷(Tris)缓冲溶液(1ommol·L一,T‘s+10nunol·L一,Nael,pH=7.4),并稀释至c(HS-ssDNA)为16林mol·L一‘.其完全匹配靶标DNA的碱基顺序为5’一TAGGAATAGTTAT几入ACTGGCCG-Te价T叮’Ae一3‘(摩尔质量为95049·mol一‘),不完全匹配靶标DNA的碱基(9个碱基错配)顺序为5‘-CCC「l’『1,GCCCTTATAACTGGCCGTCGI,『l’rl,’l,AC一3’(摩尔质量为93289·mol一勺,将其分别溶于Tris杂交Fig.1Plotsoffrequency仍讹admittanee(均梁金玲等:电化学石英晶体微天平研究界面电场对DNA杂交的影响1423式中,绷为组装探针分子后下降的电极频率,Sf为质量灵敏度j临炊为DNA探针分子的摩尔质量,A为电极面积.由实验数据求得探针分子在电极表面自组装单层的覆盖度约为2.2xlol“molecules·cm--z.L4EQCM监测杂交过程将修饰了探针分子的工作电极浸人Tris杂交缓冲溶液中,通高纯氮气30而n.当电极电位由开路电位转到所控电位时,并未引起明显的电极频率变化,这表明电位转换并未引起电极表面探针分子脱附,待工作电极频率稳定后(在30而n内频率变化范围在2一3Hz),往Tris杂交缓冲溶液中滴加靶标DNA溶液,用EQCM现场监测不同界面电场下DNA的杂交过程,把电极频率变化趋于稳定时作为杂交终点.通过公式(2)计算表观杂交效率(功,之{//司一下澎韶篡·‘00%(2)式中,蛾为杂交过程中下降的电极频率(纵与对应的蛾均在同一工作电极上得到),肠曰侧为靶标DNA的摩尔质量.假设界面变化对电极频率的影响可忽略,则鱿等效于组装到电极表面的探针分子数目,蛾等效于结合到电极表面的靶标DNA数目(主要通过与探针分子杂交的方式).由吸收光谱测得靶标DNA在杂交溶液中的浓度约为2.5xl0一7mol·L一1.2结果与讨论EQCM监测不同界面电场下DNA探针分子与完全匹配靶标DNA和不完全匹配靶标DNA杂交过程的结果分别如图2和图3所示.从图2可看出,工作电极表面荷正电时,探针分子与完全匹配的靶标DNA杂交后,电极频率下降33Hz(曲线a,实验测以一z工十/队阅020406080t/mxn图2与完全匹配靶标DNA杂交时频率对时间的响应Fig,2Responseoffrequencyontimeforhybridizationofae帅PlementarytargetDNA图3与不完全匹配靶标DNA杂交时频率对时间的响应Fig.3ResPonseoffrequeneyontimeforhybrid加ationofanon·eomPlementa即targetDNA得该电极在自组装探针分子单层后,频率下降59Hz),计算可得表观杂交效率为56%;工作电极表面荷负电时,探针分子与完全匹配的靶标DNA杂交后,电极频率下降25Hz(曲线b,该电极在自组装探针分子单层后,频率下降64Hz),计算可得表观杂交效率为39%.从图3可看出,电极表面荷正电时,探针分子与不完全匹配的靶标DNA杂交后,电极频率下降27Hz(曲线a,该电极在自组装探针分子单层后,频率下降62Hz),表观杂交效率为44%;电极表面荷负电时,在探针分子与不完全匹配的靶标DNA杂交过程电极的频率响应和背景时频率响应一致(曲线b),表明此时基本上没有错配杂交.以上结果表明,电极表面荷正电时,探针分子与完全匹配的靶标DNA的表观杂交效率较高,与不完全匹配的靶标DNA有明显的杂交响应(假阳性);而电极表面荷负电时,探针分子与完全匹配的靶标DNA的表观杂交效率稍低,但与不完全匹配的靶标DNA没有杂交响应.引人界面电场后,在电极表面探针分子与靶标DNA杂交时,存在DNA分子间互补碱基对的氢键,分子与电极表面的非特异性吸附,分子间和分子与电极表面间的库仑力等各种微观作用力.其中,电极表面荷正电时,DNA与电极表面间的库仑力表现为吸引力;当电极表面荷负电时,DNA与电极表面间的库仑力表现为排斥力.当工作电极表面荷正电时,滴加完全匹配的靶标DNA后,大量带负电荷的靶标DNA通过库仑吸引力迁移到工作电极附近,使靶标DNA在电极附近的浓度升高,增大了与探针分子杂交的几率.但是,探针分子此时在电极表面为平躺吸附取向‘151,该取向使探针分子与电极表面的非特异性吸附达到最大,从而大人35一Chim.Sin.,200了Vol23大减弱了DNA杂交的特异性.靶标DNA要克服DNA与电极表面间的库仑吸引力,DNA分子间的库仑排斥力以及探针分子与电极表面的非特异性吸附,才能与探针分子杂交.所以,在电极表面荷正电时DNA的杂交与在溶液相的杂交有很大不同.我们认为电极表面荷正电时能测得较强的杂交信号,除了通常认为的探针分子和靶标DNA完全互补杂交的响应外,还可能有以下因素:(l)探针分子只和靶标DNA的局部互补碱基形成了氢键;