单级自养脱氮系统中厌氧氨氧化菌的分子生物学鉴定

书书书中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１０，３０（６）：６０?６４单级自养脱氮系统中厌氧氨氧化菌的分子生物学鉴定黄俊丽１　邹寒艳１　王贵学１　方　芳２　郭劲松２（１重庆大学生物工程学院　重庆　４０００３０）（２重庆大学三峡库区生态环境教育部重点实验室　重庆　４０００３０）摘要　对具有厌氧氨氧化作用的细菌进行更深入的分析有助于了解该菌在生物脱氮过程的应用。对稳定运行、氨氮转化率及总氮去除率分别达到９０％及８０％左右的单级自养脱氮系统的底部取活性污泥，采用分子生物学方法提取活性污泥细菌总ＤＮＡ，利用特异引物Ｐｌａ４６ｒｃ／Ａｍｘ８２０对单级自养脱氮系统中的厌氧氨氧化菌１６ＳｒＤＮＡ基因进行ＰＣＲ扩增。扩增产物经克隆、测序及ＢＬＡＳＴ分析，结果表明该单级自养脱氮系统中存在的厌氧氨氧化菌与ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＫｕｅｎｅｎｉａｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓ和ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＢｒｏｃａｄｉａａｎａｍｍｏｘｉｄａｎｓ的１６ＳｒＤＮＡ序列同源性达９９％，进化分析证明与ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＫｕｅｎｅｎｉａｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓ进化上较为接近。关键词　单级自养脱氮系统　厌氧氨氧化菌　鉴定　１６ＳｒＤＮＡ中图分类号　Ｑ９３－３３１收稿日期：２００９１２３０　　修回日期：２０１００３１５国家自然科学基金资助项目（５０６０８０７１）电子信箱：[e-mail]　　氮素是引起水体富营养化的主要因素之一，氮污染物一直是污水处理和水污染控制的焦点问题，各种生物脱氮新工艺的开发也成为环境科学与工程领域的研究热点。与传统的硝化、反硝化脱氮过程相比，单级自养脱氮系统是在同一反应器中完成氨氮的硝化和反硝化的新型脱氮工艺之一［１］。由于该系统在运行过程中无需外加碳源，从而有效克服了传统硝化反硝化工艺需以有机电子供体支持反硝化的问题，可节省１００％的碳源和６２．５％的耗氧量［２］。因此，单级自养脱氮工艺将为废水脱氮提供一种经济有效的处理手段。　　目前单级自养脱氮系统的脱氮机理尚不清楚。一般认为，单级自养脱氮工艺可通过亚硝化和厌氧氨氧化的工艺组合方式实现［３］，即由亚硝化细菌和厌氧氨氧化细菌共同作用完成氨氮的转化［１，４］。首先，由亚硝化菌将部分ＮＨ４＋氧化为ＮＯ２，然后，厌氧氨氧化细菌利用ＮＨ４＋或ＮＨ２ＯＨ作为电子供体将ＮＯ３和ＮＯ２还原，生成氮气，完成氨氮的最终转化［５］。但由于厌氧氨氧化细菌生长缓慢，培养与增殖均复杂和困难，厌氧氨氧化菌微生物方面的研究进展缓慢［４］，因此目前采用传统的微生物分离培养方法还无法分离纯化培养厌氧氨氧化菌［５］，而分子生物学方法在一定程度上可以克服这些局限性，因此成为当前研究厌氧氨氧化菌的重要手段［６］。分子生物学方法主要包括：通过ＰＣＲ扩增检测ＡＮＡＭＭＯＸ微生物［７］、用ＦＩＳＨ检测ＡＮＡＭＭＯＸ菌［８］、高级的ＦＩＳＨ方法测定ＡＮＡＭＭＯＸ菌的活性［ＦＩＳＨ和微自动放射线照相技术（ＦＩＳＨＭＡＲ）和ＦＩＳＨ靶标在１６Ｓ和２３ＳｒＲＮＡ基因间的间隔区域（ＩＳＲＦＩＳＨ）］［９］等。本研究利用稳定运行、氨氮转化率及总氮去除率分别达到９０％及８０％的单级自养脱氮系统，从富集的厌氧氨氧化污泥中提取细菌总ＤＮＡ，采用厌氧氨氧化菌１６ＳｒＤＮＡ的分子生物学方法，对单级自养脱氮系统中的厌氧氨氧化菌进行分析，以期为探明单级自养脱氮系统的机理研究提供理论支持。１　材料与方法１．１　厌氧氨氧化污泥实验研究的活性污泥样品取自驯化两年多的单级自养脱氮反应器［１０］。该反应器接种污泥采自重庆市渝北区城南污水处理厂曝气池中的好氧污泥和唐家桥污水处２０１０，３０（６）黄俊丽等：单级自养脱氮系统中厌氧氨氧化菌的分子生物学鉴定理厂浓缩池的污泥。接种污泥在温度为３０℃、ｐＨ为８．０左右的条件下，加入人工配制氨氮废水进行逐步培养和驯化。人工配制氨氮废水中，不含有机碳，ＮＨ４ＨＣＯ３浓度为１００～３００ｍｇ／Ｌ，以Ｎ∶Ｐ比为１０∶１的比例加入磷酸盐缓冲溶液，另外加入Ｆｅ、Ｍｇ等微量元素，以ＮａＨＣＯ３调节溶液ｐＨ值。本研究中取污泥样品时，系统已完成启动过程，处于稳定运行状态，氨氮转化率及总氮去除率分别达到９０％及８０％左右［１１］。１．２　主要试剂　　ｐＭＤ１９Ｔ克隆ＰＣＲ产物载体（ｐＭＤ１９ＴＳｉｍｐｌｅＶｅｃｔｏｒ）、感受态细胞制备试剂盒（ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎＫｉｔ）、ＤＮＡ标准分子量（ＤＮＡＭａｒｋｅｒ）、Ｔａｑ酶（ＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ）购自ＴａＫａＲａ公司；ｐｆｕＤＮＡ聚合酶（ｐｆｕＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ）购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＤＮＡ凝胶回收纯化试剂盒（ＧｅｌＥｘｔｒａｃｔｉｏｎＫｉｔ）、质粒提取试剂盒（ＰｌａｓｍｉｄＭｉｎｉＫｉｔⅠ）购自Ｏｍｅｇａ公司；三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ），乙二胺四乙酸（ＥＤＴＡ），十六烷基三乙基溴化铵（ＣＴＡＢ），磷酸钠，ＮａＣｌ购自北京鼎国生物技术发展中心。大肠杆菌ＪＭ１０９菌株为本实验室保存。　　厌氧氨氧化菌１６ＳｒＤＮＡ特异引物［４］由上海英骏生物公司合成。正向引物Ｐｌａ４６ｒｃ：５′ＧＧＡＴＴＡＧＧＣＡＴＧＣＡＡＧＴＣ３′，反向引物Ａｍｘ８２０：５′ＡＡＡＡＣＣＣＣＴＣＴＡＣＴＴＡＧＴＧＣＣＣ３′。１．３　污泥细菌总ＤＮＡ的提取　　总ＤＮＡ提取方法见参考文献［１２］，稍加改进。自单级自养脱氮系统的底部取活性污泥，称０．５ｇ于５ｍｌ离心管中，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心３０ｓ弃上清，用ＴＥ缓冲液（Ｔｒｉｓ·ＨＣｌ１０ｍｍｏｌ／Ｌ，ＥＤＴＡ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ，ｐＨ８．０）反复冲洗３次，加入０．２ｇ聚乙烯聚吡咯烷酮（ＰＶＰＰ）及３ｍｌＤＮＡ提取液（１００ｍｍｏｌ／ＬＴｒｉｓ·ＨＣｌｐＨ８．０，１００ｍｍｏｌ／ＬＥＤＴＡ·ＮａｐＨ８．０，１００ｍｍｏｌ／ＬＮａ３ＰＯ４ｐＨ８．０，１．５ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ，１０ｇ／ＬＣＴＡＢ），混匀，于液氮中速冻后，转至６５℃水浴３～５ｍｉｎ；加入２０μｌ蛋白酶Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ），上下颠倒充分混匀，置于３７℃摇床振荡２０ｍｉｎ（２２５ｒ／ｍｉｎ）；加入６００μｌ１０％ＳＤＳ，６５℃水浴１ｈ，期间每隔１５～２０ｍｉｎ颠倒混匀；室温离心（１２０００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，收集上清液；加入０．２ｇ聚乙烯吡咯烷酮（ＰＶＰ）混匀于室温下结合２０ｍｉｎ后，离心（１２０００ｒ／ｍｉｎ）１０ｍｉｎ，收集上清液；加入等体积的氯仿异戊醇（Ｖ∶Ｖ＝２４∶１）抽提，收集上清液；加０．６Ｖ冷的异丙醇，室温沉淀３０ｍｉｎ，室温离心（１２０００ｒ／ｍｉｎ）２０ｍｉｎ，用冷的７０％乙醇洗涤沉淀，自然风干，溶解于５０μｌ无菌水中；取３μｌ进行１％琼脂糖凝胶电泳检测。１．４　厌氧氨氧化菌１６ＳｒＤＮＡ部分序列的ＰＣＲ扩增　　采用厌氧氨氧化菌特异性引物对Ｐｌａ４６ｒｃ／Ａｍｘ８２０进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ反应体系为（２５μｌ）：２．５μｌ的１０×ＰＣＲｂｕｆｆｅｒ（不含ＭｇＣｌ２）、１μｌｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）、１．５μｌ的ＭｇＣｌ２（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）、１μｌ每种引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）、１μｌ的Ｔａｑ酶（２．５Ｕ／μｌ）、１μｌ的模板和适量的双蒸水补足２５μｌ。ＰＣＲ反应条件为９４℃预变性４ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５６℃退火４５ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，３０个循环，７２℃下延伸５ｍｉｎ。ＰＣＲ产物用１．０％琼脂糖凝胶电泳检测。１．５　ＰＣＲ产物的３′加Ａ及克隆　　加Ａ的反应程序如下：在ＰＣＲ反应管中加入１μｌ纯化的ＰＣＲ产物、１μｌ１０×Ｔａｑ酶反应缓冲液、１μｌ的ｄＡＴＰ（２ｍｍｏｌ／Ｌ）、１．５μｌＴａｑ酶（５Ｕ／μｌ）、灭菌三蒸水５．５μｌ，将上述各成份混匀，在７２℃下恒温１７ｍｉｎ。　　按照ＰＣＲ产物纯化试剂盒说明书对ＰＣＲ产物进行纯化。用载体连接试剂盒将纯化产物连接到ｐＭＤ１９上，取１０μｌ连接产物转化感受态细胞Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９，转化液涂布于含ＸＧａｌ（５溴４氯３吲哚βｄ半乳糖苷）／ＩＰＴＧ（异丙基βＤ硫代半乳糖苷）／Ａｍｐ（氨苄青霉素）的ＬＢ固体培养基，３７℃过夜培养，进行蓝白斑筛选。挑取白斑于终浓度为５０ｍｇ／ｍｌＡｍｐ的ＬＢ液体培养基，３７℃振荡过夜培养，提取阳性克隆质粒（命名为ｐＭＤ１９ＡＮＡ）。１．６　阳性克隆的鉴定及序列分析　　阳性克隆质粒稀释５０倍做模板，对阳性克隆进行ＰＣＲ鉴定，反应体系和反应条件如上；用ＥｃｏＲⅠ及用ＥｃｏＲⅠ／ＨｉｎｄⅢ对阳性克隆分别进行单酶切及双酶切鉴定，根据鉴定结果挑出的阳性克隆送上海英骏生物工程技术服务有限公司测序。测得的序列ＢＬＡＳＴ在ＧｅｎＢａｎｋ中搜索相近序列（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）。同时将该序列与已发表的相关细菌的１６ＳｒＤＮＡ序列以ＣｌｕｓｔａｌＸ软件进行分析，用Ｐｈｙｌｉｐ软件以ＮＪ法构建进化树，并对构建的树进行Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ分析。２　结果与分析２．１　细菌总ＤＮＡ提取　　提取的活性污泥总ＤＮＡ溶液经过１．０％的琼脂糖凝胶电泳，从图１可见２３ｋｂ左右有明亮条带，表明已获得较长片段的污泥微生物的总ＤＮＡ。另外，从图中１６中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ．３０Ｎｏ．６２０１０也能看见明显的拖带和弥散，但由于本研究使用改进的土壤ＤＮＡ提取方法，对后面的ＰＣＲ扩增影响不大。图１　活性污泥总ＤＮＡ电泳图Ｆｉｇ．１　ＧｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｏｔａｌＤＮＡ１：ＤＮＡｍａｒｋｅｒ（λＤＮＡ／ＨｉｎｄＩＩＩ）；２：ＴｏｔａｌＤＮＡｆｒｏｍｃｕｌｔｉｖａｔｅｄｓｌｕｄｇｅ２．２　厌氧氨氧化菌１６ＳｒＤＮＡ部分序列ＰＣＲ扩增　　本研究所采用的Ｐｌａ４６ｒｃ是浮孢霉类细菌的特异引物，Ａｍｘ８２０是厌氧氨氧化细菌的特异引物［１３］，国内外研究采用这一对引物作为厌氧氨氧化菌的特异引物，多扩增出８００ｂｐ左右的条带，并据此证实是厌氧氨氧化菌［１４１６］。本研究采用上述引物对扩增出１条约８３０ｂｐ的目的条带（图２），与其它研究用这对引物扩增得到的条带大小接近，初步证实本研究中的单级自养脱氮系统含有厌氧氨氧化菌。图２　厌氧氨氧化菌１６ＳｒＤＮＡ部分序列的ＰＣＲ扩增Ｆｉｇ．２　ＰＣＲａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＡＮＡＭＭＯＸｂａｃｔｅｒｉａ１６ＳｒＤＮＡｐａｒｔｉａｌｓｅｑｕｅｎｃｅ１：１００ｂｐｌａｄｄｅｒ；２～４：ＡＮＡＭＭＯＸｂａｃｔｅｒｉａｐａｒｔｉａｌ１６ＳｒＤＮＡｂｙＰＣＲ；５：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ２．３　阳性克隆的鉴定及序列分析　　对阳性克隆子进行ＰＣＲ鉴定（图３），可见明亮的目的片段，说明目的片段已经成功连接入ｐＭＤ１９Ｔ载体上；对重组子ｐＭＤ１９ＡＮＡ进行单酶切及双酶切鉴定（图４），从而证实了阳性克隆确实连入目的片段。　　测序得８３３ｂｐ的序列已在ＮＣＢＩ中ＧｅｎＢａｎｋ中登录，登录号为：ＧＱ３５９８５９。该序列与ＮＣＢＩ中其它厌氧氨氧化菌１６ＳｒＤＮＡ基因序列进行ＢＬＡＳＴ比对后证实图３　阳性克隆子ｐＭＤ１９ＡＮＡ的ＰＣＲ鉴定Ｆｉｇ．３　ＰｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ１：ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅡ；２：ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｆｒｏｍｐＭＤ１９ＡＮＡ；３：Ｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ图４　阳性克隆子ｐＭＤ１９ＡＮＡ的酶切鉴定Ｆｉｇ．４　Ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｂｙｄｉｇｅｓｔｉｏｎ１：ＤＮＡｍａｒｋｅｒⅡ；２：ｐＭＤ１９ＡＮＡ／ＥｃｏＲＩ；３：ｐＭＤ１９ＡＮＡ／ＥｃｏＲＩ＋ＨｉｎｄＩＩＩ本研究中的单级自养脱氮系统中存在厌氧氨氧化菌，该厌氧氨氧化菌与目前已鉴定出的两种淡水自养厌氧氨氧化菌ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＢｒｏｃａｄｉａａｎａｍｍｏｘｉｄａｎｓ和ＣａｎｄｉｄａｔｕｓＫｕｅｎｅｎｉａｓｔｕｔｔｇａｒｔｉｅｎｓｉｓ同源性均达９９％，属于自养厌氧氨氧化菌属；通过进化树分析（图５），本研究克隆的厌