Vazyme-荧光定量PCR(qPCR)技术讲座资料

MakeyourqPCRREAL-FromprinciplestoapplicationsDr.LJZhang,2013Vazyme,ChinaReal-timePCR(qPCR)•Real-timePCR优势•Real-timePCR检测原理与常用名词•基本原理(数学/化学)•应用相对定量绝对定量•PCR定量qPCR宏基因组单个基因（表达）•PCR定量qPCR•PCR定量qPCRN=N0x2n•PCR定量qPCRN=N0x2n（2，扩增效率）•PCR定量qPCRN=N0x2n非指数扩增期指数扩增期N=N0x1.9nN=N0x1.8nN=N0x1.7n。。。。。。。•PCR定量qPCRN=N0x2n非指数扩增期指数扩增期N=N0x1.9nN=N0x1.8nN=N0x1.7n。。。。。。。检测灵敏度平台期指数期线性期平台期qPCR指数期N=N0x2n比较不同样品间某基因的‘量’Choice1（半定量PCR）:N=N0x2n等循环数（n），N0=N/2nChoice2（qPCR）:N=N0x2n等产物量（N），LgN0=–nxLg2+LgNqPCR指数期N=N0x2nChoice1（半定量PCR）Choice2（qPCR）•半定量PCRVSqPCRqPCR显著差异差异微弱Choice1半定量PCR•半定量PCRVSqPCRqPCR显著差异Choice2qPCR•半定量PCRVSqPCR差异显著！qPCR没有差异显著差异Choice2qPCRChoice1半定量PCR•半定量PCR（等n）重现性差、定量“失真”•qPCR（等N）重现性好、定量“天然”qPCR荧光定量PCR实时定量PCR。。。。。。qPCR对数期等N定量qPCR•等N测定方式(Real-time，实时)•PCR阶段划分线性图谱对数图谱qPCR•基线、阈值、CT值线性图谱对数图谱qPCR•基线、阈值、CT值基线SDX10，10-5qPCR•基线、阈值、CT值线性图谱对数图谱基线期与指数期接合部扩增曲线与阈值的交点qPCRqPCR基本原理化学原理：变“N”为荧光，测定荧光值反应“N”的量数学原理：通过循环数“n”（Ct值）来计算N0qPCR化学原理化学原理：变“N”为荧光，测定荧光值反应“N”的量DNA的荧光标记(染料、荧光基团)•1.Hydrolysisprobes(TaqMan,Beacons)•2.HybridizationorFRETprobes(LightCycler)•3.DNA-binding(intercalating)agents(SYBRGreen,EvaGreen,LCGreen)qPCR化学原理荧光(染料、荧光基团)SYBRTaqManqPCR化学原理•SYBR一种DNA小沟非饱和性结合染料与DNA结合时发光/不结合(游离)时不发光每形成一条DNA双链，就会有一定数量的染料结合上去染料一结合，就会产生荧光信号信号强度与DNA分子总数目成正比qPCR化学原理•TaqManProbe一种水解探针(5’Reporter,3’Quencher)完整时不发光/水解后发光每形成一条DNA链，就会水解一条探针每水解一条探针，就会产生一个单位信号信号强度与结合过探针的DNA分子总数目成正比qPCR化学原理•SYBRVSTaqManProbeSYBRTaqManAssaysthatrequireslowspecificityAssaysthatrequireshighspecificityDetectionofgeneexpressedathighlevelDetectionofraretranscriptsGeneralscreeningoftranscriptspriortomovingtoprobebasedassaysLowlevelpathogendetectionMultiplexreactionsAllelicdiscriminationassaysqPCR数学原理•数学原理：通过循环数“n”（Ct值）来计算N0起始DNA量VSCTqPCR数学原理N=N0x2nqPCR数学原理N=N0×(1+e)nN产物分子数N0起始分子数e扩增效率n循环数qPCR数学原理•定量数学原理，DNA量VSCT？qPCR数学原理•定量数学原理，DNA量VSCT？qPCR数学原理•定量数学原理，DNA量VSCT？qPCR应用•绝对定量•相对定量•等位基因型分析•阴阳性鉴定•MicroRNA分析。。。。。。qPCR应用-绝对定量•根据标准品，测定样品中基因表达量的绝对值xxx个拷贝qPCR应用-绝对定量•根据标准品，测定样品中基因表达量的绝对值xxx个拷贝qPCR应用-绝对定量•根据标准品，测定样品中基因表达量的绝对值xxx个拷贝qPCR应用-绝对定量•根据标准品，测定样品中基因表达量的绝对值xxx个拷贝qPCR应用-相对定量•测定不同样品中基因表达量的相对值xxx倍Sample1Sample2Ct:25Ct:26基因表达量Sample1/Sample2=2△Ct:-1qPCR应用-相对定量•测定不同样品中基因表达量的相对值xxx倍样本量差异-RNA差异-逆转录差异-cDNA差异Calibrator！！！(内参，Normalizer)Sample1Sample2Ct:25Ct:26基因表达量Sample1/Sample2=2△Ct:-1qPCR应用-相对定量•测定不同样品中基因表达量的相对值xxx倍Sample1Sample2Ct:25Ct:26内参Ct:20内参Ct:22△Ct:5△Ct:4△△Ct：1基因表达量Sample1/Sample2=1/2SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理不要轻易相信qPCR数据！SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理样品制备（细胞、组织）对照设置！–后期数据有效性分析重要指标阴性对照阳性对照实验组SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理如前所述注意事项RNA完整性、纯度逆转录模板用量尽可能一致cDNA质量（普通PCR测定）基因组污染情况（NRT对照）SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理始终选择表达充沛、均一的基因做为内参基因不要盲目选择常用的内参基因最好能够通过实验确认样品处理方式对所选内参基因的表达无影响常用内参基因GAPDH，Actin，Tublin18s（无PolyAtail）SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理成功关键！引物长度（17bp-25bp）产物长度100～200bp3’端应尽量避免高GC或高AT含量区域。3’端最后一个碱基最好为G或者C，避免使用T。正反向引物的Tm值最好相差不要超过1℃。GC含量（40%-60%）引物A、G、C、T整体分布尽量要均匀避开T/C或者A/G的连续结构避开引物内部或者两条引物之间的互补序列NCBIBLAST2～3对SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理好的开始是成功的一半！扩增特异性有无二聚体扩增效率计算常用二聚体去除方法提高模板浓度降低引物使用量提高退火温度改两步法为三步法SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理硬件配置要过硬！移液器、枪头、qPCR管、定量仪器注意事项：准确移液至少3重复（统计要求）模板稀释后以大体积加入反应体系尽可能不使用边上的孔防污染常规方法：模板制备、反应体系配制、反应区、电泳区物理隔离超净工作台关风使用过的枪头、EP管密封存放使用带滤芯的枪头移液器专用SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理反应有效性确认扩增曲线3复孔重复性良好，NTC在30循环内无扩增曲线出现熔解曲线单峰，峰前后曲线平坦SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理2-△△Ct法设定引物扩增效率为1，即PCR每循环产物量翻倍则Xn=X0×2nX0=Xn/2n设定定量样品为A和B，基因表达量分别为A0,B0则A0=An/2n，B0=Bn/2n依据SYBR定量原理，荧光信号正比于PCR产物量。现制定一个荧光信号阈值（threshold），标记此时的产物量为T。则，当荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数即为Ct值。此时A0=T/2CtA，B0=T/2CtB此时比较样品B和A中起始基因表达量的差异可得如下公式：B0/A0=(T/2CtB)/(T/2CtA)=(1/2CtB)/(1/2CtA)=2CtA/2CtB=2CtA-CtB=2-(CtB-CtA)(2-△Ct)SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理2-△△Ct法为消除样品cDNA浓度差异，引入内参基因进行浓度校正。设定内参基因起始表达量为H0（样品A和样品B中无差异，故也称之为管家基因）。首先分别计算两样品种目标基因与内参基因的表达量差异，公式如下：H0/A0=(T/2CtHA)/(T/2CtA)=(1/2CtHA)/(1/2CtA)=2CtA/2CtHA=2CtA-CtHA=2-(CtHA-CtA)A0=H0/2-(CtHA-CtA)H0/B0=(T/2CtHB)/(T/2CtB)=(1/2CtHB)/(1/2CtB)=2CtB/2CtHB=2CtB-CtHB=2-(CtHB-CtB)B0=H0/2-(CtHB-CtB)因此B0/A0=(H0/2-(CtHB-CtB))/(H0/2-(CtHA-CtA))=2-(CtHA-CtA)/2-(CtHB-CtB)=2(CtHB-CtB)-(CtHA-CtA)即B0/A0=2–[(CtB-CtHB)-(CtA-CtHA)]（2-△△Ct)SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理2-△△Ct法多数情况下，引物扩增效率都不为1SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理2-△△Ct法多数情况下，引物扩增效率都不为1，需要做如下调整：设定扩增效率为e，PCR产物扩增方程应修改为：X0=Xn/(1+e)n设定目标基因扩增效率为eX，内参基因扩增效率为eHA0=H0/[(1+eX)CtA/(1+eH)CtHA]B0=H0/[(1+eX)CtB/(1+eH)CtHB]则B0/A0=[(1+eX)CtA/(1+eH)CtHA]/[(1+eX)CtB/(1+eH)CtHB]=[(1+eX)CtA-CtB]/[(1+eH)CtHA-CtHB]即B0(1+eX)-(CtB-CtA)A0(1+eH)-(CtHB-CtHA)=e=10[–1/slope]-1SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理荧光定量PCR数据有效性国际标准试