RT-PCR步骤

RT-PCR步骤RNA提取（-80℃保存）1.取50-100mg组织加入1mlTrizol，剪碎，振荡30s2.转入一新EP管中（1.5ml），室温保存5min3.加氯仿0.2ml，振荡混合（手摇剧烈），室温放置5min4.12000rpm4℃离心15min5.转移上层水相（吸70%）到一新EP管中，加异丙醇0.5ml,振荡混合，室温保存10min6.12000rpm4℃离心15min7.倒掉上清，加1ml75%无水乙醇（4℃保存），振荡混合，7500rpm4℃离心5min8.倒掉上清，室温或37℃放置20min(EP管倒置在滤纸上)使RNA沉淀干燥9.加20ulDEPC水至EP管中10.在50℃孵育3-5min(或手握3-5min),使RNA充分溶解注意：操作过程中带手套口罩，所用到的仪器设备须经去除RNA酶处理（灭菌或DEPC水浸泡）测RNA浓度（以750ul体系为例）11.调零：750ulDEPC水12.测量：745ulDEPC水+5ulRNA13.总RNA浓度=OD260×40×稀释倍数（150倍）ug/ml14.=OD260×40×150ug/ml15.=OD260×6ug/ul16.A260/A280应在1.8-2.0之间逆转录（cDNA：一周内-20℃保存，长期-80℃保存）方法一：以通用试剂盒为例，反应体系20ul1.RNA短暂离心2.RNA模板0.5-2ug,再加入Oligo(dt)1ul,加DEPC水补齐至10ul.轻轻混合均匀，短时间离心3.将反应液置于65℃5min冰上1min,短时间离心4.按顺序加入：5×buffer4ul200ul核糖核苷酸酶抑制剂0.5ul10mmdNTPMIX1ul逆转录酶1ulRNase-freeH2O3.5ul轻轻混合均匀，短时间离心5.将混合物置于37℃，60min6.75℃加热15min,中止上述反应，置于冰上注意事项1.RNA提取和逆转录时所用器具均应在1‰DECP水中避光浸泡过夜，再高压烘干2.DECP水配制（先加DEPC，再加水，避光过夜，然后高压）3.75%无水乙醇配制（DEPC水：无水乙醇=1:3）4.RNA提取和逆转录时应全程佩戴一次性手套和口罩聚合酶链反应PCR(产物-20℃保存)方法一：1．25ul的反应体系，冰上操作，稍后短时间离心Template1ul/3ulPrimer11ulPrimer21ul10*TaqBuffer5uldNTPs(10mM)1ulTaq酶1ulddH2O补至25ul(9.5ul/7.5ul)2.PCR循环:①94℃5min②94℃45s③Tm+4℃45s④72℃45s229-34(从第2步开始循环30-35个循环)⑤72℃10min⑥4℃12hPCR结束后-20℃保存或置于冰上开始电泳。退火温度计算2（AT）4（GC）正反义平均数，再上下波动度（±4℃，或±5℃）引物稀释方法1.引物先离心，后用DEPC水或双蒸水稀释成10倍母液2.再取5ul母液，加45ulDEPC水或双蒸水稀释10倍成操作液