水中主要阳离子对铜绿微囊藻生长及多糖的影响-郭丽丽

生态环境学报2013,22(8):[e-mail]基金项目：江苏省重点基金项目（BK2011025）；江苏省水利科技项目（2011069）作者简介：郭丽丽(1989年生)，女，硕士研究生，主要从事微囊藻生理特性及水华形成研究。E-mail:[e-mail]收稿日期：2013-04-23水中主要阳离子对铜绿微囊藻生长及多糖的影响郭丽丽1，朱伟1,2，李明11.河海大学环境学院，江苏南京210098；2.水资源高效利用与工程安全国家工程研究中心，江苏南京210098摘要：通过室内培养试验，在65μmol·m-2·s-1光照度和12h∶12h光暗比下，模拟野外水体中铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)的生长，研究了水中主要阳离子Ca、Mg、K、Na质量浓度的变化对铜绿微囊藻生长以及多糖的影响。依据自然水体中Ca、Mg、K、Na的实际浓度水平结合已有研究得到的抑制浓度，试验分别设定了5个质量浓度梯度的培养基，其中Ca质量浓度梯度为0、10、20、50、100mg·L-1，Mg质量浓度梯度为0、2、5、10、20mg·L-1，K质量浓度梯度为5、10、20、50、100mg·L-1，Na质量浓度梯度为18、30、50、100、200mg·L-1。试验测定的生理生化指标包括培养周期内每天铜绿微囊藻的藻细胞密度和对数生长期内铜绿微囊藻溶解性胞外多糖（sEPS）、固着性胞外多糖（bEPS）和胞内多糖（IPS）的含量。试验结果表明：低质量浓度的Ca对微囊藻的生长没有明显影响，高质量浓度的Ca(50mg·L-1)会抑制铜绿微囊藻的生长但同时铜绿微囊藻合成多糖总量（TPS）会增加，Ca质量浓度的增大对铜绿微囊藻胞外多糖的分泌呈现先促进后抑制的趋势，并在刺激铜绿微囊藻细胞分泌多糖的同时会促进其溶解。Mg缺失时，铜绿微囊藻的生长会受到显著的抑制，较高质量浓度的Mg(5mg·L-1)也会抑制铜绿微囊藻的生长但同时铜绿微囊藻合成多糖总量（TPS）会增加，Mg在适宜质量浓度(5mg·L-1)会抑制多糖分泌、防止多糖溶解。K离子质量浓度的变化对微囊藻的生长无明显影响但铜绿微囊藻TPS的量呈现先增加后减少的趋势，K对多糖的分泌并没有显著影响，但对多糖的溶解呈现先促进后抑制的作用。Na离子质量浓度的变化对铜绿微囊藻的生长以及合成TPS的量均无明显影响，Na质量浓度增大对多糖的分泌的影响与Ca的一致，但影响的程度明显小于Ca的影响，其质量浓度的增加对多糖的溶解过程有轻微的促进作用。关键词：阳离子；铜绿微囊藻；生长；多糖；抑制中图分类号：Q178.1文献标志码：A文章编号：1674-5906（2013）08-1358-07引用格式：郭丽丽，朱伟，李明.水中主要阳离子对铜绿微囊藻生长及多糖的影响[J].生态环境学报,2013,22(8):1358-1364.GUOLili,ZHUWei,LIMing.EffectofmajorcationsinwateronthegrowthandpolysaccharidecontentsofMicrocystisaeruginosa[J].EcologyandEnvironmentalSciences,2013,22(8):1358-1364.富营养化引起的蓝藻水华频繁发生是我国众多湖泊(太湖、巢湖、滇池等)面临的重要环境问题之一[1]，这其中以微囊藻水华最为常见。研究人员发现水华发生时微囊藻多以群体的形态存在。Yamamoto等[2]在2009年夏季对台湾84个池塘微囊藻的群体大小和微囊藻在浮游植物中的相对比例进行了调查，发现微囊藻的相对比例与其群体大小存在显著正相关关系，并认为群体在微囊藻水华发生过程中起到关键作用。一些研究人员发现群体在防御捕食[3,4]、抵御强光和有毒有害物质侵害[5-7]以及更快地垂向迁移等方面都具有单细胞不具备的优势。近些年，微囊藻群体的形成机理和影响因素已成为微囊藻水华发生机理研究中的热点问题，受到大量研究人员的关注。Kessel等[8]在观察微囊藻的亚显微结构时指出群体是由胶被包裹新分裂的细胞而形成的。Plude等[9]对水华微囊藻的胶被成分进行了分析，结果显示这层胶被的主要成分为多糖类化合物。此后，Yang等[10]通过浮游动物捕食诱导微囊藻形成群体时发现群体的形成通常伴随着胞外多糖的增加。Li等[11]发现微囊藻的群体直径与胞外多糖含量存在明显的正相关关系，而胞外多糖与胞内多糖也存在显著的正相关关系。可见多糖的合成和分泌与微囊藻形成群体和维持群体形态有着密不可分的关系。微囊藻多糖的直接来源是光合作用。已有的研究显示营养盐、光照、温度、pH等都会对多糖的合成和分泌产生影响。施军琼等[12]在2008年研究了环境因子对铜绿微囊藻胞外多糖的影响，认为较高浓度的N和光强，会使合成的总糖减少但sEPS的量显著增多。雷腊梅等[13]在2007年研究认为丰富的N显著刺激EPS的产生，P丰富的条件也轻微刺激EPS的产生。代晓炫等[14]研究了营养元素N、P对微囊藻多糖组成的影响，发现N、P浓度的升高均会使微囊藻总糖含量降低，N浓度的增加还会郭丽丽等：水中主要阳离子对铜绿微囊藻生长及多糖的影响1359促进多糖向胞外分泌和溶解。JoseMoreno等[15]于1998年发现温度升高可以促进鱼腥藻的胞外多糖的释放。陈长平等[16]在2006研究发现当盐度和pH分别大于底栖硅藻的最适生长盐度和pH时，会通过增加EPS来缓解胁迫，说明EPS的存在可以缓解外界的不良环境对藻生长的影响。杨州等[17]认为不同光谱、光强和光周期均可影响其胞外多糖的合成与分泌。阳离子(Ca、Mg、K、Na)影响着微囊藻的新陈代谢过程，从而影响着微囊藻的生长状况以及合成有机物的能力。Wang等[18]研究发现100mg·L-1的Ca能够促进微囊藻多糖的增加促使微囊藻形成群体。而苏彦平等[19]通过对太湖夏秋季节水体和蓝藻细胞内各种矿物元素进行分析，发现藻体对水体环境中的元素有选择吸收功能，富集能力大小依次为KMgCaNa。Plude等[9]研究发现微囊藻胞外固着性多糖中含有相当质量浓度的Ca、Mg、K、Na。Parker等[20]发现这些离子直接影响着多糖的粘度，同时还发现一定浓度的Ca有利于溶解性多糖的沉淀。Ca参与了细胞壁的构成，能把生物膜表面的磷酸盐、磷酸酯与蛋白质的羧基桥接起来，从而稳定生物膜结构，保持细胞膜对离子的选择性吸收功能。Na、K元素对细胞内的物质传输有着重要作用，而Mg作为合成叶绿素的重要元素，会影响光合作用，更是许多酶的活化剂，并参与了碳水化合物代谢过程[21]。可见，Ca、Na、Mg、K对微囊藻的生长及多糖的合成、分泌、溶解性可能存在很大的影响，但目前这些离子对微囊藻不同形态多糖的影响很少有定量的分析。本研究的主要目的是明确水中主要阳离子对微囊藻多糖合成、分泌和溶解的影响，以期进一步探索蓝藻水华暴发过程中的限制元素，为今后调控相关限制因子来控制水华提供理论依据。1材料与方法1.1藻种和试验参数试验所用藻种为铜绿微囊藻MicrocystisaeruginosaFACHB-469，藻种购自中国科学研究院武汉水生生物研究所藻种库。培养试验采用M11培养基(100mgNaNO3、10mgK2HPO4、75mgMgSO4∙7H2O、40mgCaCl2∙2H2O、20mgNaCO3、6mg柠檬酸铁和1mgNa2EDTA∙2H2O、1L蒸馏水)，使用250mL锥形瓶，试验均在恒温光照培养箱中进行，设置温度25℃，光照度为65μmol·m-2·s-1，光暗比12h∶12h，光照期间每天摇瓶3次并随机调换锥形瓶的位置以保证光照均匀，暗期静置。初始接种藻密度为5×104cells·mL-1，整个试验过程均保持无菌操作。1.2培养基的配置试验设置了Ca、Mg、K、Na4个控制组，依据自然水体中Ca、Mg、K、Na的实际浓度结合已有研究得到的抑制浓度，每组设置5个质量浓度梯度，各3个平行。Ca组、Mg组以分别剔除了CaCl2∙2H2O和MgSO4∙7H2O的M11培养基为基础，K组以原M11培养基为基础，Na组以NaNO3含量减半的M11培养基为基础。通过改变添加CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KCl、NaCl的量来改变培养基中Ca、Mg、K、Na的质量浓度。试验设置Ca质量浓度梯度为0、10、20、50、100mg·L-1，Mg质量浓度梯度为0、2、5、10、20mg·L-1，K质量浓度梯度为5、10、20、50、100mg·L-1，Na质量浓度梯度为18、30、50、100、200mg·L-1。1.3测定指标及方法处于对数生长期的藻细胞生理特性一致，细胞组分稳定，因此取培养至对数生长期的藻样进行测定。测定指标有：藻细胞密度、三种形态多糖含量。藻细胞密度：藻细胞密度与藻液的吸光度之间存在显著线性相关关系[22]，用分光光度计(岛津UV-2450)对原藻种进行了400~800nm吸收扫描，确定本藻种的最大吸收波峰为680nm，取一定量藻液，按不同倍数稀释后，用紫外分光光度计分别测定其在680nm处的吸光度；另吸取1mL藻液经鲁格试液固定，用血球记数板在显微镜下记数，建立藻细胞密度与吸光度之间的关系曲线：生物量(106cell·mL-1)=A680×24.693−0.3282(r2=0.9982)。藻细胞密度可通过测定吸光度后用此关系曲线换算得到。多糖：本试验采用杨州[10]的分类方法测定了3种不同类型的多糖：溶解性胞外多糖sEPS、固着性胞外多糖bEPS和胞内多糖IPS。取藻液20mL，在10500r·min-1转速下离心15min使藻液分离，取上清液测定溶解性胞外多糖sEPS。上述离心后的藻团加入10mL去离子水，再加入0.5mg·L-1NaOH溶液调节pH为10，摇匀后置于水浴震荡器中，45℃震荡4h(60r·min-1)，然后10500r·min-1离心15min，上清液用于测定固着性胞外多糖bEPS。第2次离心后的藻团加0.5mg·L-1NaOH后沸水浴10分钟使胞内多糖溶解出来，加入体积分数17%的三氯乙酸沉淀色素和蛋白，再10500r·min-1离心15min，上清液用于测定胞内多糖IPS含量。取上述3次的滤液各2mL用蒽酮法测定多糖含量。最后结合藻细胞密度可计算出单细胞所含胞外多糖EPS和胞内多糖IPS的量。1.4生长曲线的拟合应用logistic方程拟合不同培养条件下微囊藻1360生态环境学报第22卷第8期（2013年8月）的增长过程，每个处理组的最大生物量作为各自K的估计值，通过logistic方程的对数形式：ln[(K−N)/N]=a−rt以最小乘法进行回归分析，获得微囊藻生长方程的斜率和截距作为a和r的估计值。2结果2.1钙、镁、钾、钠质量质量浓度对铜绿微囊藻生长的影响图1显示了不同Ca、Mg、K、Na质量浓度下铜绿微囊藻的生长状况，由图可知培养的前4天铜绿微囊藻生物量的增长幅度很小，此时铜绿微囊藻处于生长的适应期。第5天开始铜绿微囊藻生物量的增长加快，铜绿微囊藻进入了对数生长期。Ca控制组中低质量浓度的Ca（50mg·L-1）对铜绿微囊藻生长的影响较小，而随着Ca质量浓度的升高，铜绿微囊藻的生长逐渐受到抑制。第9天时无Ca培养液中铜绿微囊藻的生物量为2600万cells·mL-1，Ca质量浓度为100mg·L-1的培养液中铜绿微囊藻的生物量只有1600万cells·mL-1，生物量降低了40%。Mg控制组中Mg质量浓度的升高和缺失对铜绿微囊藻的生长有不同程度的抑制作用，其中无Mg培养液中铜绿微囊藻的生长明显受到抑制，到第7天生物量的增长已经基本停止。K、Na控制组中K、Na质量浓度的变化并未对铜绿微囊藻的生长产生显著的影响，Na控制组中铜绿微囊藻在第7天生物量就开始趋于稳定。2.2不同钙、镁、钾