基因表达的半定量PCR检测

基因表达的半定量PCR检测实验目的：以cDNA为模板，利用PCR技术制备目的基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde3-phosphatedehydrogenase，GAPDH）的大量拷贝，以便进行目的基因的克隆；此实验还包括PCR引物设计，PCR产物的琼脂糖电泳检测等内容。实验原理：真核细胞含有三类基本RNA：核糖体RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）、转移RNA（tRNA）。其中mRNA传递合成蛋白质的全部遗传信息，是蛋白质生物合成的中间环节，具有特殊意义。Trizol试剂可从细胞中快速提取细胞总RNA，将其中的mRNA逆转录成cDNA，以一对特异性引物对目的cDNA进行聚合酶链式反应扩增。由于每个循环中合成的引物延伸产物可作为下一循环中的模板，因而每次循环中靶DNA的拷贝数呈几何级数增长，因此，30次PCR循环将产生约1亿倍（230）的扩增片段。PCR技术又称聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction）技术，是一种在体外（试管）扩增核酸的技术。该技术模拟体内天然DNA的复制过程。其基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶（TaqDNApolymerase）存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。每一循环包括高温变性、低温退火、中温延伸三步反应。每一循环的产物作为下一个循环的模板，如此循环30次，介于两个引物之间的新生DNA片段理论上达到230拷贝（约为109个分子）。PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性（图3-1）。PCR反应的基本步骤包括高温变性（denaturation）；低温退火（annealing）；中温延伸（extension）三步反应（图3-2）。①变性（denaturation）（95℃）；②退火(annealing)；③延伸(elogation)（72℃）图3-1PCR扩增DNA原理示意图图3-2PCR实验中各种组分的剂量：（1）dNTP常用浓度为20~200μM，不能低于10~15μM。（2）引物浓度一般在0.1~1.0μM。（3）Mg2+浓度范围通常为0.5~2mM。（3）在100μlPCR反应中，1.5~2U的TaqDNA聚合酶就足以进行30轮循环。（4）一般反应中的模板数量为102~105个拷贝，对于单拷贝基因，这需要0.1μg的人基因组DNA，10ng的酵母DNA，1ng的大肠杆菌DNA；扩增多拷贝序列时，用量更少。（5）反应缓冲液：反应缓冲液一般含10~50mMTris-HCl(20℃下pH8.3-8.8)，50mMKCl和适当浓度的Mg2+。Tris-HCl在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中，pH为6.8-7.8。50mM的KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5mM的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性。各种TaqDNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。PCR既可以扩增制备全长基因（图3-3），也可以扩增基因片段（图3-4）。图3-3PCR扩增全长基因图3-4PCR扩增基因片段Two-stepRT-PCR实验材料：[1].cDNA：实验2获得的cDNA。使用前用紫外分光广度计测定浓度。[2].taq酶：5U/μl；附带10×PCRbuffer(w/Mg)：20mMMgSO4,100mMKCl,80mM(NH4)2SO4,100mMTris-HCl,pH9.0,0.5%NP-40。上海申能博彩生物科技有限公司。[3].4×dNTP混合物：10mM每种单核苷酸（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）；上海申能博彩生物科技有限公司。[4].小鼠GAPDH基因PCR扩增引物（扩增产物168bp）：GAPDH-F1：5'-DIG/Biotin-GTGGCAAAGTGGAGATTGTT-3'Tm值：54.8℃GAPDH-R1：5'-DIG/Biotin-CTCGCTCCTGGAAGATGG-3'Tm值：55.7℃[5].小鼠GAPDH全长基因PCR扩增引物（扩增产物1002+14bp）：GAPDH-F2：5′-GCGGGTACCATGGTGAAGGTCGGTGTGAACGG-3′GAPDH-R2：5′-CGCGTCGACTTACTCCTTGGAGGCCATGTAGG-3′上游引物内含KpnI酶切位点（下划线者）；下游引物内含SalI酶切位点。[6].小鼠β-actin基因PCR扩增引物（扩增产物156bp）：β-actin-F：5'-CATCACTATCGGCAATGAGC-3'β-actin-R：5'-GACAGCACTGTGTTGGCATA-3'[7].DNAmarker：[8].琼脂糖：[9].溴化乙锭(EB)：10mg/ml水溶液。[10].6×凝胶载样缓冲液：0.25%溴芬蓝，0.25%二甲苯青FF，40%（w/v）蔗糖。注意：在0.5~1.4%的琼脂糖凝胶中，溴芬蓝的泳动速率是二甲苯青FF的2.2倍；溴芬蓝的泳动速率约与300bp的双链线状DNA的泳动速率相同，而二甲苯青FF的泳动速率约与4kb的双链线状DNA的泳动速率相同。因此，两种染料可指示DNA在凝胶电泳中的迁移位置，判断电泳是否应该停止。实验步骤：1、半定量PCR反应[1].按顺序将下表各成分加入200μl薄壁PCR管：[2].将PCR反应管瞬时离心，混匀反应液；[3].将PCR反应管置于PCR仪上，盖好PCR仪顶盖。[4].执行下列程序：94℃预变性3min；30个循环：94℃变性45s,57.6℃复性40s,72℃延伸1.5min；72℃延伸10min；4℃保温。2、PCR产物电泳分析[1].配制1.0%琼脂糖凝胶，加入终浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭(EB)；[2].取5μlPCR终产物及DNAmarker，以0.5×TBE为缓冲液，电压100V电泳。期间根据溴芬蓝和二甲苯青FF在凝胶中的迁移位置及其欲检测的靶DNA分子的大小决定电泳是否已经达到应该停止的时间；若达到，停止电泳。[3].紫外透射仪或凝胶照相仪上观察DNA扩增情况；依据DNAmarker判断是否有预期的扩增产物；评价扩增条件：特别是扩增程序的复性温度（决定扩增产物的特异性）。[4].用凝胶照相系统观察凝胶图象并拍照保存；用凝胶照相系统附带的分析软件对PCR产物条带进行区带密度分析；[5].计算目的基因（GAPDH）的区带与内参（β-actin）区带的密度比，结果表示目的基因与内参mRNA的比值。注意事项：小鼠GAPDH基因引物F1/R1PCR扩增引物（扩增产物168bp）5'端带有DIG标记（也可以使用其他标记，如Biotin等）的目的是回收纯化PCR产物，用于后面的实验中做核酸杂交探针