21第二十一章--药品质量控制中现代分析方法的进展

第二十一章药品质量控制中现代分析方法的进展返回主目录基本要求第一节毛细管电泳及其应用第二节超高效液相色谱及其应用第三节手性HPLC技术与应用第四节GC-MS技术与应用第五节LC-MS技术与应用第六节液相色谱-核磁共振联用技术2基本要求熟悉药物分析主要新技术及其原理和特点了解药物分析新技术的发展3第一节毛细管电泳及其应用毛细管电泳（CE）：又称高效毛细管电泳（highperformancecapillaryelectrophoresis，HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电场为驱动力的新型液相分离技术。包含电泳、色谱及其交叉内容，它使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。优点：高效；高速；微量；低消耗分离过程电场作用下，毛细管柱中出现：电泳现象和电渗流现象。带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流；两种速度的矢量和。阳离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反。ν电渗流ν电泳时,阴离子在负极最后流出除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。电泳在电解质溶液中，位于电场中的带电离子在电场力的作用下，以不同的速度向其所带电荷相反的电极方向迁移的现象，称之为电泳。由于不同离子所带电荷及性质的不同，迁移速率不同，可实现分离。1808年，Reuss（俄国）首次发现电泳现象。1937年，Tiselius（瑞典）用于人血清蛋白质混合液的分离：发现样品的迁移速度和方向由其电荷和淌度决定；第一次的自由溶液电泳；第一台电泳仪；1948年，获诺贝尔化学奖；电渗流当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液-固界面形成双电层，二者之间存在电位差。当液体两端施加电压时，就会发生液体相对于固体表面的移动，这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流（electroosmoticflow，简称EOF）。一、毛细管区带电泳（CZE）带电粒子的迁移速度=电泳和电渗流速度的矢量和。正离子：两种效应的运动方向一致，在负极最先流出；中性粒子：无电泳现象，受电渗流影响，在阳离子后流出；阴离子：两种效应的运动方向相反；ν电渗流ν电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,同种类离子由于差速迁移被相互分离。；最基本、应用广的分离模式，主要适用于离子状态存在的样品缓冲溶液中加入离子型表面活性剂，其浓度达到临界浓度，形成一疏水内核、外部带负电的胶束。二、胶束电动毛细管色谱（MEKC）在电场力的作用下，胶束在柱中移动。2.电泳流和电渗流的方向相反，且ν电渗流ν电泳，负电胶束以较慢的速度向负极移动；5.色谱与电泳分离模式的结合。3.中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长；4.可用来分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳的应用范围；三、毛细管凝胶电泳（CGE）将聚丙烯酰胺等在毛细管柱内交联生成凝胶。其具有多孔性，类似分子筛的作用，试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高。特点：抗对流性好，散热性好，分离度极高。主要用于蛋白质、DNA等生物大分子11（四）毛细管等速电泳采用前导电质和尾随电解质，在毛细管中充入前导电质后进样，电解槽中换用尾随电解质进行电解分析，带不同电荷的组分迁移至各个狭窄的区带，然后依次通过检测器。12（五）毛细管等电聚焦电泳（六）毛细管电色谱（七）微芯片毛细管电泳二、应用已经成为药物分析的一种重要工具，被多个国家药典收载。13第二节超高效液相色谱及其应用超高效液相色谱：一种基于小颗粒填料的液相色谱技术优点：1.高分离度2.高速度3.高灵敏度4.方法转化简便5.易与质谱串联14技术特点1.填料及填料技术填料：耐高压、耐酸碱、颗粒度分布尽可能窄；填料技术：既要堵住颗粒不使其外流，又不至于引起背压的大幅升高。2.超高压液相色谱泵：除了密封、高压动力之外，还需要解决超高压下溶剂的压缩性及绝热升温问题。153.自动进样器：进样阀要密封良好，有较小的死体积。4.高速检测器：需要更快的数据采集频率，降低样品在检测池内的驻留时间。5.优化系统综合性能的设计：优化使之具有超低系统体积及死体积，保障低扩散、高速检测的优点16存在的问题溶剂的压缩性：由于溶剂压缩，升高压力后导致流量降低，需要根据设定流量补偿。摩擦热效应：流动相以相对较高速度流过固定性时摩擦生热，且之间导热效果较差，从而超成峰展宽和柱效下降。安全因素：有可能发生高流速液体喷射、管壁破裂及筛板脱离等。第三节、手性药物的高效液相色谱法一、手性药物拆分机理为了使对映体转化为化学和物理性质不同的非对映体，就要提供一种手性源，使待拆分的对映异构体（样品）、手性作用物（如固定相）和手性源之间形成一个非对映异构分子的络合物。在对映体拆分理论中颇为流行的是“三点手性识别模式”。二、手性HPLC拆分法的类型直接法：柱前手性衍生化法间接法：手性流动相拆分法、手性固定相拆分法1．柱前手性衍生化法：对映体混合物以手性试剂作柱前衍生化，形成非对映体，然后以常规（偶见手性）固定相分离。对手性衍生化试剂的要求：高光学纯度。常用的手性衍生化试剂：羧酸衍生物类、胺类、异硫氰酸酯类、异氰酸酯类、萘衍生物类、光学活性氨基酸类、固相衍生化试剂。2．手性流动相拆分法（手性洗脱法或手性流动相添加剂法）：将手性试剂加入流动相中，手性添加剂与样品形成手性络合物。常用的手性添加剂：配基交换型手性添加剂、环糊精类添加剂、手性离子对络合剂3．手性固定相拆分法：将手性选择器（如手性流动相添加剂）固着于多种基质上而制成手性固定相。迄今为止，尚没有一种通用型的手性柱，需要根据化合物的分子结构来选择合适的手性柱。常用的手性固定相：Pirkle型手性固定相、蛋白质类手性固定相、环糊精类手性固定相。（三）应用1．对某些手性药物进行对映体的纯度检查；2．生物体液中药物对映体的分离分析研究可探索血药浓度与临床疗效的关系；3．在研制手性药物过程中，可分别评价单个对映体的效价、毒性、不良反应、药动学性质；4．必要时，可进行手性药物对映体的制备分离（或拆分）。23第四节GC-MS技术与应用一、特点高速高分离效能；高灵敏；高选择性；24二、分析方法原理1.总离子流色谱法：样品离子流和本底离子流一起被收集，经放大扣除本底离子流，记录样品的总离子流。2.质量碎片图片质谱法：基于比较样品中待测组分的离子流和内标的离子流。以保留时间为横坐标，记录一个或若干个特征离子碎片的强度所构成的质量碎片图谱。25第五节LC-MS技术与应用一特点高分离能力；高灵敏；极强的结构解析能力；高专属性；分析速度快；适用范围广26二、结口技术1.电喷雾接口2.热喷雾接口3.离子喷雾接口4.离子束接口5.解吸附技术27三、应用1、在药物有关物质检测中的应用2、在药物代谢产物鉴定中的应用3、在检验中药制剂中非法添加化学药物的应用4、在兴奋剂检测及研究中的应用5、农药残留检测6、肽以及蛋白质研究28第六节液相色谱-核磁共振联用技术一、方法特点优点：使用范围广；可以判断化合物的结构等缺点：灵敏度较低；易受溶剂等因素的影响等29二、基本操作模式1、连续流动操作模式：随着色谱分离连续获得NMR特点：NMR采样时间短，很难得到分辨率良好的NMR谱图302、停流操作模式：当样品色谱峰最高点到达NMR液槽的中心位置时，停止流动，进行NMR采样分析，然后再启动输液泵，恢复正常HPLC分析，继续下一色谱峰的NMR测定。特点：获得较好的NMR谱，但是易出现峰的扩散拖尾现象。313、峰存贮操作模式：当检测到色谱峰时，将流出物收集并贮存到不同的毛细管回路内，由NMR逐一离线测定。特点：即可获得分辨率高的NMR图，又可以避免峰扩散拖尾。