高极性分子分析方法开发策略

高极性分子的保留与方法开发全策略高极性分子的保留与方法开发全策略高极性分子的保留与方法开发全策略高极性分子的保留与方法开发全策略—从反相到从反相到从反相到从反相到HILIC©2015WatersCorporation1沃特世化学品部市场技术王悦[e-mail]概概概概要要要要
反相反相反相反相保留策略保留策略保留策略保留策略
HILIC保留原理与注意事项保留原理与注意事项保留原理与注意事项保留原理与注意事项
HILIC有关色谱柱的选择与应用特色有关色谱柱的选择与应用特色有关色谱柱的选择与应用特色有关色谱柱的选择与应用特色©2015WatersCorporation2概概概概要要要要
反相反相反相反相保留策略保留策略保留策略保留策略
HILIC保留原理与注意事项保留原理与注意事项保留原理与注意事项保留原理与注意事项
HILIC有关色谱柱的选择与应用特色有关色谱柱的选择与应用特色有关色谱柱的选择与应用特色有关色谱柱的选择与应用特色©2015WatersCorporation3保留极性化合物的各主要色谱方法比较保留极性化合物的各主要色谱方法比较保留极性化合物的各主要色谱方法比较保留极性化合物的各主要色谱方法比较技术技术技术技术优点优点优点优点缺点缺点缺点缺点离子交换离子交换离子交换离子交换
能保留任何可离子化的化合物
使用高浓度缓冲盐或pH梯度来进行洗脱–不兼容于质谱检测技术
如分析物不能电离时则保留不佳
能保留任何可离子化的化合物
柱平衡所需时间很长
难以运行梯度
不能与质谱检测技术兼容©2015WatersCorporation4离子对反相离子对反相离子对反相离子对反相
能在同一根色谱柱上进行离子配对色谱操作和反相色谱操作
不能与质谱检测技术兼容
方法开发时摸索条件不便
试剂纯度对色谱影响大
一经使用，则使色谱柱发生化学变性反相反相反相反相
普遍熟悉此技术
柱效高（峰塔板数高）
柱平衡迅速
可选色谱柱极多
在水相中容易发生“疏水塌陷”
对极性分子保留不佳HILIC亲水保留亲水保留亲水保留亲水保留
高有机比例流动相有利于质谱检测灵敏度
可省去SPE流出物挥干复溶步骤而直接进行LC进样分析
样品在流动相中的溶解度
尚未被广泛理解
操作细节易忽略保留极性化合物的各主要色谱方法比较保留极性化合物的各主要色谱方法比较保留极性化合物的各主要色谱方法比较保留极性化合物的各主要色谱方法比较技术技术技术技术优点优点优点优点缺点缺点缺点缺点离子交换离子交换离子交换离子交换
能保留任何可离子化的化合物
使用高浓度缓冲盐或pH梯度来进行洗脱–不兼容于质谱检测技术
如分析物不能电离时则保留不佳
能保留任何可离子化的化合物
柱平衡所需时间很长
难以运行梯度
不能与质谱检测技术兼容©2015WatersCorporation5离子对反相离子对反相离子对反相离子对反相
能在同一根色谱柱上进行离子配对色谱操作和反相色谱操作
不能与质谱检测技术兼容
方法开发时摸索条件不便
试剂纯度对色谱影响大
一经使用，则使色谱柱发生化学变性反相反相反相反相
普遍熟悉此技术
柱效高（峰塔板数高）
柱平衡迅速
可选色谱柱极多
在水相中容易发生“疏水塌陷”
对极性分子保留不佳HILIC亲水保留亲水保留亲水保留亲水保留
高有机比例流动相有利于质谱检测灵敏度
可省去SPE流出物挥干复溶步骤而直接进行LC进样分析
样品在流动相中的溶解度
尚未被广泛理解
操作细节易忽略疏水塌陷疏水塌陷疏水塌陷疏水塌陷:会产生什么现象呢会产生什么现象呢会产生什么现象呢会产生什么现象呢?
当我们压力一旦停止，再启动时，我们观察到死时间（V0）和保留时间的漂移，表明颗粒表面内孔排出了水相流动相*1–10%死时间的漂移–23%分析物保留时间的丢失ACQUITYUPLC®BEHC18L=5cm©2015WatersCorporation6Minutes0.200.400.600.801.001.20Vo漂移L=5cmF=0.3mL/minP=2,040T=90oC%Dewet=23.10*1T.H.Walter,P.IranetaandM.CapparellaJ.Chromatogr.A1075(2005)177-1831.25必须允许流动相进入内孔以保证待分析和分离的化合物能够为何发生为何发生为何发生为何发生““““疏水塌陷疏水塌陷疏水塌陷疏水塌陷””””？？？？——色谱填料孔内干涸色谱填料孔内干涸色谱填料孔内干涸色谱填料孔内干涸色谱填料是多孔颗粒（“海绵”），99％发生色谱分离的表面是在内孔表面流动相©2015WatersCorporation7证待分析和分离的化合物能够和色谱填料有保留反相色谱填料内孔表面“干涸”将大大影响到色谱分离如果内孔“干涸”，则样品不能够进入色谱填料的内孔表面，则该化合物将不能在色谱柱上保留。Analyte极性保留反相专用柱极性保留反相专用柱极性保留反相专用柱极性保留反相专用柱XSelectHSST3/AtlantisT3用于极性分子保留的业内标杆产品用于极性分子保留的业内标杆产品用于极性分子保留的业内标杆产品用于极性分子保留的业内标杆产品：：：：
硅胶基质硅胶基质硅胶基质硅胶基质C18柱柱柱柱，，，，特别设计用于反相保留极性化合物特别设计用于反相保留极性化合物特别设计用于反相保留极性化合物特别设计用于反相保留极性化合物
大大增强对极性化合物的保留能力大大增强对极性化合物的保留能力大大增强对极性化合物的保留能力大大增强对极性化合物的保留能力©2015WatersCorporation8
与与与与100%水相完美兼容水相完美兼容水相完美兼容水相完美兼容
三键键合三键键合三键键合三键键合C18，，，，增强填料的耐受性增强填料的耐受性增强填料的耐受性增强填料的耐受性
完美兼容完美兼容完美兼容完美兼容LC-MS
[HSS]有完全一致的有完全一致的有完全一致的有完全一致的UPLC/UHPLC/HPLC分析柱分析柱分析柱分析柱
[Atlantis]有完全一致的制备柱可供放大有完全一致的制备柱可供放大有完全一致的制备柱可供放大有完全一致的制备柱可供放大T3对极性化合物的卓越的保留与峰形性能对极性化合物的卓越的保留与峰形性能对极性化合物的卓越的保留与峰形性能对极性化合物的卓越的保留与峰形性能对嘌呤碱表现良好峰形Compounds:1.Cytosine2.5-Fluorocytosine3.Uracil4.5-Fluorouracil5.Guanine6.Thymine7.Adenine7ConditionsColumn:Atlantis®T34.6x100mm,3µmMobilePhaseA:10mM乙酸铵,pH5.0MobilePhaseB:乙腈FlowRate:1.0mL/minGradient:TimeProfile(min)%A%B0.0100010.094615.0946InjectionVolume:10.0µLSampleConcentration:400µg/mLtotalSampleDiluent:waterTemperature:30°C尿嘧啶尿嘧啶尿嘧啶尿嘧啶(Uracil)是测试反相柱最广泛采用的死体积标记物,但在AtlantisT3柱上有显著保留©2015WatersCorporation9123456Minutes1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.007V0=1.83minSampleDiluent:waterTemperature:30°CDetection:UV@254nmSamplingRate:5pts/secInstrument:WatersAlliance®2695,2996PDA切实增强对极性化合物的保留切实增强对极性化合物的保留切实增强对极性化合物的保留切实增强对极性化合物的保留——与其它品牌“水相柱”相比1.Thiourea(N)2.5-Fluorocytosine(B)3.Adenine(B)4.Guanosine-5'-monophosphate(A)©2015WatersCorporation104.Guanosine-5'-monophosphate(A)5.Thymine(N)注：所示色谱柱性能比较情况，与具体操作条件相关，并不代表所有应用情况T3：三键键合C18，增强抗流失性T3保留和分离保留和分离保留和分离保留和分离9种种种种有机酸有机酸有机酸有机酸（（（（HPLC））））©2015WatersCorporation11T3保留和分析保留和分析保留和分析保留和分析儿茶酚儿茶酚儿茶酚儿茶酚（（（（HPLC））））©2015WatersCorporation12沃特世应用资料沃特世应用资料沃特世应用资料沃特世应用资料：：：：wa60224(英文英文英文英文)12种水溶性维生素的同时种水溶性维生素的同时种水溶性维生素的同时种水溶性维生素的同时、、、、快速分析快速分析快速分析快速分析（（（（LCMS））））ACQUITYUPLCHSST3©2015WatersCorporation13沃特世应用资料沃特世应用资料沃特世应用资料沃特世应用资料：：：：720003052ZH（（（（中文中文中文中文）T3：：：：鸡肉中的利巴韦林鸡肉中的利巴韦林鸡肉中的利巴韦林鸡肉中的利巴韦林LCMS分析分析分析分析样品前处理方案鸡肉样品加入10mM乙酸铵及磷酸脂酶，37度孵育1小时。离心后取1mL加入9mL乙腈，混合离心后待净化。Sep-PakPSA(3cc/500mg)P/N186004536活化/平衡©2015WatersCorporation14乙腈：水9：1上样品清洗乙腈：水9：1洗脱乙腈：水1：1上机分析反相保留策略的一些考虑反相保留策略的一些考虑反相保留策略的一些考虑反相保留策略的一些考虑
减少质谱信号的灵敏度–需要使用高水相条件来保留分析物–在高水流动相的条件下，质谱检测中去溶剂效率更低
如果分析物发生电离，保留会变弱甚至保留很差©2015WatersCorporation15
如果分析物发生电离，保留会变弱甚至保留很差–碱性分析物在低碱性分析物在低碱性分析物在低碱性分析物在低pH流动相条件下保留变弱流动相条件下保留变弱流动相条件下保留变弱流动相条件下保留变弱是否有其他选择增加化合物的反相保留呢是否有其他选择增加化合物的反相保留呢是否有其他选择增加化合物的反相保留呢是否有其他选择增加化合物的反相保留呢?流动相的流动相的流动相的流动相的pH值值值值2025303540容量因子(k)有机酸中性化合物注:中性化合物的保留与pH无关碱的高保留平台区酸的高保留平台区流动相流动相流动相流动相pH条件对反相保留的重要影响条件对反相保留的重要影响条件对反相保留的重要影响条件对反相保留的重要影响©2015WatersCorporation16pH051015024681012容量因子有机碱硅胶柱的硅胶柱的硅胶柱的硅胶柱的pH应用范围应用范围应用范围应用范围杂化颗粒柱的pH应用范围酸的低保留平台区碱的低保留平台区使用高使用高使用高使用高pH条件条件条件条件，，，，可同时增加保留与响应可同时增加保留与响应可同时增加保留与响应可同时增加保留与响应碱性分析物碱性分析物碱性分析物碱性分析物！！！！–吗啡及其代谢物吗啡及其代谢物吗啡及其代谢物吗啡及其代谢物%HIGHpH0.1%NH4OH51234610-hydroxymorphineMorphine-3ß–o-glucuronide©2015WatersCorporation17Compounds1.10-hydroxymorphine2.Morphine-3β-D-glucuronide3.Morphine-6β-D-glucuronide4.Morphine5.MorphineN-oxide6.6-acetylmorphineMinutes0.200.400.600.801.001.201.401.601.802.002.202.402.602.803