takara-RACE说明书

TakaraCode：D3155’-FullRACEKit（10次量）宝生物工程(大连)有限公司说明书目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存2●试剂盒原理3●特异性引物的设计要求3●试剂盒特点4●RNA样品制备4●试剂盒使用注意4●使用ControlHL60TotalRNA时的5′RACE实验例5●实验样品的5′RACE操作方法8●实验例12●Q&A12●制品说明本试剂盒是高灵敏度、高特异性扩增cDNA5′末端全长的试剂盒。使用RT-PCR方法扩增目的DNA时，一般很难得到全长的cDNA片段，在基因工程研究中，分析遗传基因的全长cDNA序列十分重要。RACE（RapidAmplificationofcDNAEnds）法能有效解决这一问题。Takara5′-FullRACEKit能够通过已知的cDNA序列，高灵敏度、高特异性地扩增cDNA的5′末端的全长序列。本试剂盒应用了“去帽法”原理，TobaccoAcidPyrophosphatase（TAP）可以去掉mRNA的5′帽子结构，使用T4RNALigase将5′RACEAdaptor连接到mRNA的5′端后，可以使用5′RACEAdaptor上的引物与已知序列部分的引物进行RT-PCR反应，高特异性地扩增cDNA5′末端的全长序列。本试剂盒中含有完成5′RACE操作的主要试剂。试剂盒中使用的ReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）经过了本公司的特殊改良，反转录性能良好，无RNaseH活性，大大增加了反转录性能。结合使用TaKaRaLATaq®（TakaraCode：DRR02AM）进行PCR扩增时，其5′RACE的扩增性能大大优于其他同类产品。本试剂盒应用了套式PCR原理，增加了PCR扩增的特异性与灵敏度，可以对少量样品或低丰度的基因进行5′RACE实验，并且对长片段的5′RACE扩增具有明显优势。5′RACEInnerPrimer中含有BamHI酶切位点，为克隆提供了方便。使用TaKaRaLATaq®扩增得到的PCR产物的3′端附有一个“A”碱基，可直接克隆于T-Vector中。试剂盒中提供的ControlHL60TotalRNA可作为ControlRNA，使用ControlPrimer可扩增HumanProhibitin（PHB）基因5′末端约750bp的DNA片段。本试剂盒具有以下特点：1.扩增cDNA的5′末端全长序列。应用了“去帽法”原理，可以有效扩增cDNA的5′末端全长序列。2.高灵敏度的5′RACE扩增。采用了套式PCR法，对低丰度的基因或极少量的RNA样品同样可以进行5′RACE实验。3．高特异性的5′RACE扩增。套式PCR法的使用，大大提高了5′RACEDNA片段扩增的特异性。4．长片段5′RACE扩增。试剂盒中使用了本公司特殊改良的M-MLV（RNaseH-）反转录酶，反转录性能良好，使长片段的RT-PCR扩增成为了可能。●制品内容（10次量）ForRNATreatedReactions（10次量）：AlkalinePhosphatase（Calfintestine）（16U/μl）10μl10×AlkalinePhosphataseBuffer（MgCl2Free）50μlTobaccoAcidPyrophosphatase（0.5U/μl）10μl10×TAPReactionBuffer10μl5′RACEAdaptor（15μM）10μlT4RNALigase（40U/μl）10μl5×RNALigationBuffer*180μl40%PEG#6000200μl3MCH3COONa（pH5.2）400μlNACarrier40μlRNaseInhibitor（40U/μl）35μlReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）（200U/μl）10μl5×M-MLVBuffer20μldNTPMixture（10mMeach）10μlRandom9mers（50μM）10μlRNaseFreedH2O2×1ml-1-For5′RACEPCRReactions（50次量）：1×cDNADilutionBufferII400μl5′RACEOuterPrimer（10μM）100μl5′RACEInnerPrimer（10μM）100μlForControlReactions（5次量）：ControlHL60TotalRNA（1μg/μl）*210μl5′RACEControlOuterPrimer（10μM）*210μl5′RACEControlInnerPrimer（10μM）*210μl*1此Buffer带有颜色，长时间保存有时会产生沉淀，请离心后取上清使用，不会影响反应性能。*2用于扩增HumanProhibitin（PHB）基因5′末端约750bp的DNA片段。【各种引物序列】【本试剂盒以外需要自备试剂】①扩增目的基因的下游特异性引物。②PCR用DNA聚合酶。推荐使用扩增性能良好的TaKaRaLATaq®（TakaraCode：DRR02AM）或保真性能极高的PrimeSTARHSDNAPolymerase（TakaraCode：DR010）。③PCR产物克隆试剂（如：T载体等）。④苯酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）。⑤氯仿。⑥异丙醇。⑦100%预冷乙醇。⑧70%预冷乙醇。●保存：-20℃。-2-引物名称引物序列（5’→3’）长度5′RACEOuterPrimerCATGGCTACATGCTGACAGCCTA23mers5′RACEInnerPrimerCGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG34mers5′RACEControlOuterPrimerAGGTAGGTGATGTTCCGAGAGCGT24mers5′RACEControlInnerPrimerTTGGAGTCGCCCTCAGCAGAGAT23mers●试剂盒原理图5′-FullRACE的扩增原理图【操作步骤】1.使用AlkalinePhosphatase（Calfintestine）［简称CIAP］去掉TotalRNA中裸露的5′磷酸基团。2.使用TobaccoAcidPyrophosphatase［简称TAP］去掉mRNA的5′帽子结构，保留一个磷酸基团。3.使用T4RNALigase将5′RACEAdaptor连接到去帽后的mRNA上。4.以上述3的mRNA作为模板，使用ReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-），Random9mers进行反转录反应合成cDNA。5.使用下游外侧特异性引物GSP1和5′RACEOuterPrimer进行OuterPCR反应，再使用下游内侧特异性引物GSP2和5′RACEInnerPrimer进行InnerPCR反应。PCR产物可以进行DNA克隆或直接进行DNA测序。●特异性引物的设计要求请使用引物设计专用软件进行设计，大体要求如下：1.引物长度以20-28nt为宜。2.引物中的GC含量一般为45%-55％，GC、AT分布均匀，应尽量避免局部富含GC或AT。3.引物最好不形成二级结构（发夹结构等），与5′RACEOuterPrimer和5′RACEInnerPrimer不能形成复杂结构。4.引物3′端的3～4个碱基不要与配对引物形成互补序列。-3-●试剂盒特点原理使用TobaccoAcidPyrophosphatase去掉mRNA的5′帽子结构，连接接头后进行cDNA5′末端的全长扩增。RNA模板适用于所有真核生物的TotalRNA。基因种类可适用于丰度较低或者较难扩增的基因。扩增片段大小最长能得到3.2kb的PCR扩增产物。反转录酶ReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）无RNaseH活性，反转录能力强。扩增特点采用NestedPCR方法，大大提高了PCR扩增的特异性及灵敏度。●RNA样品制备本试剂盒是扩增cDNA5′末端全长的试剂盒。RNA的完整性和纯度会影响5′RACE的结果。而制备RNA的关键是要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施：戴一次性干净手套，使用RNA操作专用实验台，在操作过程中避免讲话等等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA分解酶的污染。【使用器具】尽量使用一次性塑料器材，若用玻璃器材时应在使用前按下列方法进行处理。（1）用0.1%DEPC（焦碳酸二乙酯）水溶液在37℃下处理12小时。（2）然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具和仪器建议专门使用，不要用于其他实验。【试剂配制】用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌（180℃，3小时以上）或用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装（也可使用RNA实验用的一次性塑料容器），使用的无菌水须用0.1%的DEPC处理后进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。【制备方法】推荐使用TakaraRNAisoPlus系列产品或其他RNA提取试剂或试剂盒进行RNA的提取。使用Catrimox®-14RNAIsolationKitVer.2.11（TakaraCode：DWA005）可从血液中快速提取高纯度的TotalRNA。●试剂盒使用注意以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前请一定认真阅读！1．进行5′RACE实验时，为提高RACE结果的可信度，应同时进行TAP（-）和M-MLV（-）的负对照实验。TAP（-）即：RNA经去磷酸化反应后不进行TAP处理，直接进行5′RACEAdaptor的连接及后续实验，以验证RNA去磷酸化是否充分。如果充分，RT-PCR将不能扩增。但是，真正进行TAP（-）负对照实验时，由于不能保证100%的去磷酸化，往往会有RT-PCR扩增结果，但其扩增片段长度一般不同于目的片段。M-MLV（-）即：5′RACEAdaptor连接反应后进行RT反应时不添加M-MLV，以排除基因组DNA污染造成的假阳性结果。如果M-MLV（-）的负对照实验没有特异性扩增，说明5′RACE结果来源于mRNA。2．同时进行几个样品的反应时，应先配制各种试剂的混合液（MasterMix），然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验之间产生的误差。3．使用AlkalinePhosphatase（Calfintestine）、TobaccoAcidPyrophosphatase、T4RNALigase、ReverseTranscriptaseM-MLV（RNaseH-）和RNaseInhibitor等酶类时，应轻轻混匀，避免起泡，分取之前要小心离心收集到反应管底部。由于酶粘度高，分取时应慢慢吸取。4．酶制品应在实验前才从-20℃中取出，使用后也应立即放回-20℃中保存。-4-5．为了防止ControlRNA和5′RACEAdaptor降解，应尽量避免反复冻融。有条件的实验室最好保存于-70℃。6．分装试剂时务必使用新的枪头（Tip），以防止样品间污染。●使用ControlHL60TotalRNA时的5′RACE实验例在本实验中，使用5′RACEControlPrimer可以扩增HumanProhibitin（PHB）基因5′末端约750bp的DNA片段。具体操作方法如下：1．去磷酸化处理。使用AlkalinePhosphatase（CIAP）对TotalRNA中裸露的5′磷酸基团进行去磷酸反应。①按下列组份配制去磷酸反应液。试剂使用量ControlHL60TotalRNA（1μg/μl）1μlRNaseInhibitor（40U/μl）1μl10×AlkalinePhosphataseBuffer（MgCl2Free）5μlAlkalinePhosphatase（Calfintestine）（16U/μl）0.6μ