HPLC色谱方法开发中保留因子k的深度剖析

HPLC色谱方法开发中保留因子k的深度剖析Voyager88医药大世界昨天作者：Luffy前言：保留因子作为化合物在液相上保留最重要的参数，同时它在分离度公式中占据重要的一席，因此理解好保留因子对于液相色谱方法开发具有重要意义，下面小编和大家一起剖析下保留因子k。1.1.k的定义保留因子（k）：固定相中的溶质分子总量（s）除以流动相（m）中的溶质分子总量得到。当化合物在固定相中溶质分子越多，K值越大，保留时间越长。2.k的计算（1）等度洗脱中，运用公式k=（tR-t0）/t0进行计算，其中t0约等于5x10-4Ldc2/F。式中L是色谱柱的长度，以mm为单位；dc是色谱柱的内径，也以mm为单位；F是流动相流速，以ml/min为单位；t0以分钟为单位；其中5x10-4Ldc2为色谱柱的死体积Vm。举例来说，对于4.6mm内径的色谱柱，其死体积Vm近似为0.01L，因此对于一根150x4.6mm的色谱柱，如果使用流速为0.5ml/min，那么t0=Vm/F=1.5/0.5=3分钟；然后根据待测样品的保留时间tR就可以计算出该色谱峰的k值了。（2）在梯度洗脱中，条件比较复杂，k值计算公式为0.87tGf/vmΔΦs。其中tG为梯度时间，F为流速，Vm为色谱柱的死体积，ΔΦ为梯度范围，一般分子量为100-500Da的化合物S大约为4，根据此公式我们同样可以计算出梯度洗脱中化合物的k值。1.3.k的使用原则在进行HPLC方法开发时一般要求k为1到10，最大容许范围为2-20。在这个范围内我们可以得到又窄又高的色谱峰，同时化合物的分离能够达到最佳。如果k小于1时，化合物的分离就会很差；当化合物的k大于20时候，继续提高k值，化合物的分离度变化十分微小，但是保留时间却增加明显。1.4.k的主要影响因素（1）有机相的比例：这个是改变k值的主要首选因素，通常有机相增加10%，会导致样品的色谱峰k值下降大约2.5倍。（2）流动相pH这个主要是针对酸碱等离子化合物，比如酸性化合物一般在酸性条件下k值高，在碱性条件下k值低。（3）离子对试剂加入离子对试剂也可以改变化合物的k值的保留。1.5.k在方法开发中的应用k值的计算主要应用于初始方法开发中，先通过调整流动相中的有机相，使得所测定的化合物的k值在1-10以内。注意这里设定值是1-10，而不是到20，确定这个范围是为了后面方法进行优化的时候能够留有余地；当遇到化合物的分离度不好时，可以牺牲一部分k值进行提高化合物的分离度。但是注意k值不要到达20以上。如果k值在20时化合物的分离度还不符合要求，此时就需要更改一些其他的色谱条件了，不要再一味的进行延长化合物的保留时间了，因为此时延长保留时间对于化合物的分离度已经几乎没有影响了，而且会导致峰型变宽。同时在方法开发选择色谱柱的时候也要注意下化合物的k值，当比较不同的色谱柱对化合物分离的影响，一定要使所有的化合物能在一个同一个k值上来进行比较（此时需进行调节有机相的比例来实现），这样才能获得分离化合物最优的色谱柱。举例说明分离化合物A和B（B出峰在后），使用氨基柱、氰基柱、C18柱，首先要调节有机相比例使得化合物B的k值在不同色谱柱都在10左右，然后再看各个色谱柱对A和B的分离情况，哪个色谱柱分离最优。