第三章-细胞生物学研究方法(杨恬)

(CellBiologyResearchMethods)第三章细胞生物学研究方法内容一、细胞生物学研究方法的评价二、细胞生物学的主要研究方法及进展细胞生物学研究方法细胞生物学是一门重要的生命科学学科，生命科学的理论建立在严密的科学实验的基础上，因此，细胞生物学研究技术和方法的进步以及实验工具的革新，尤其是具有突破意义的新技术新方法的建立，必然对学科的发展起到巨大的推动作用。学习细胞生物学应该了解各种方法和技术的基本原理、主要过程和适用范围。应该认识到所有的技术和方法均有其局限性，没有任何一种方法在解决科学问题上是万能的和不可替代的。一、细胞生物学研究方法的评价电镜下细胞超微结构的观察电镜下细胞超微结构的观察细胞体外培养应该根据具体的研究对象和所处的研究条件，选择最合适的方法组合，设计最佳的技术途径以达到研究目的。昂贵的设备或者复杂的技术方法在研究中并不一定是最可靠和绝对必要的，而设计巧妙的、简明的技术路线同样可以阐明重大的科学命题。应该注意不断地改进和革新所用的工具、方法和技术，使其更加实用和完善，要善于从其他学科领域引入并建立新的技术方法和技术途径，更要努力提出和创立新的技术思路或设想，以对学科的进步做出更多的贡献。细胞生物学的研究方法的进步和实验工具的革新，尤其是具有突破意义的新技术的建立，必然对学科的发展起到巨大的推动作用。记忆形成中电极记录神经元冲动纳米丝信号诱导干细胞分化为不同类型的组织细胞。可视化技术（VisualizingCells）原位组分显示技术（DisplayingtechniquesinSitu）体外培养技术（CellandTissueCultureinVitro）细胞及其组分的分离和纯化技术（Segregationandpurificationofcellularcomponents)生物大分子的分析和鉴定技术（AnalysisandIdentificationofbiomacromolecules）其他技术（Othertechniques）二、细胞生物学的主要研究方法及进展显微成像技术帮助人们在不同的层次观察和研究组织、细胞的活动及其规律。光镜显示显微结构（microscopicstructure）,电子显微镜显示的亚微结构（submicroscopicstructure）或超微结构(ultrastructure）。（一）可视化技术（VisualizingCells）最早的一台光学显微镜光学显微镜和电子显微镜的成像原理荧光显微镜相差显微镜果蝇胚胎的基因差异性表达将带有不同荧光标记的三种抗体与果蝇早期胚胎的细胞核中特异性蛋白结合，在荧光显微镜下不同荧光标记分别发出黄、绿、蓝荧光，黄色和蓝色荧光重叠区显示红色荧光，每个小的球状荧光区域对应一个细胞核。荧光标记显示的不同蛋白质定位结果表明：在果蝇胚胎发育早期，细胞间即已出现差异，特定基因的表达开启于特定的细胞类型中，控制着果蝇身体进一步发育为重复节段。果蝇胚胎的基因差异性表达四种不同的光镜成像技术下的培养的成纤维细胞图像，大部分现代显微镜都可以通过互换光学部件获得这四种图像。A.亮视野显微镜；B.相差显微镜；C.Normarski相差显微镜；D.暗视野显微镜激光扫描共聚焦显微镜成像原理A激光经过针孔聚焦于样品的一点上。B从样品点上发出的荧光聚焦于针孔到达检测器。C从样品的其他部位发出的光线不能聚焦于针孔处，检测器无法检测，因此不能成像。激光扫描共聚焦显微镜图像及计算机三维重建图像扫描隧道显微镜、X线衍射技术和原子力显微镜等成像方法使研究者能在分子水平探索细胞的微细结构及其功能。血细胞经新型抗菌肽Phyllomelittin（猴树蛙）处理后的表面变化。对细胞及组织的多种化学成分分进行定性、定位和定量的研究。（二）原位组分展示技术（displayingtechniquesinSitu）原位组分展示技术免疫细胞化学技术（immunocytochemistry，ICC）是利用免疫学中抗原抗体特异性结合的原理来定性和定位研究器官、组织和细胞中的生物活性大分子的技术。免疫细胞化学技术放射自显影术（autoradiography）以放射性核素标记生物标本中的大分子或其前体物质，在显微和亚显微结构水平显示组织和细胞内放射性核素标记的物质的位置和数量及其变化。放射自显影术胰岛B细胞电镜放射自显影结果A.3H-亮氨酸脉冲标记完成10分钟后，被标记的胰岛素蛋白（黑色银颗粒）从粗面内质网进入高尔基复合体中；B.3H-亮氨酸脉冲标记完成45分钟后，被标记的胰岛素蛋白进入分泌颗粒内。原位杂交技术（insituhybridization，ISH）是使用标记的DNA或RNA探针，通过分子杂交检测原位组织和细胞中的特异性核酸分子的方法。原位杂交技术与原理原位杂交技术原位杂交检测全胚胎及胚胎切片上特异基因的活性A.用特异性RNA探针检测发育约10天的全鼠胚胎中Sonichedgehog基因mRNA的表达，显色结果表明SonichedgehogmRNA主要表达于脊索，即将来发育成脊柱脊髓的中胚层轴线（红箭头所示）。B.用特异性RNA探针检测鼠胚胎切片中Sonichedgehog基因mRNA的表达，结果与A图类似：在背/腹轴上的神经管下面的脊索中（红箭头所示），有SonichedgehogmRNA的表达。C.果蝇全胚胎原位杂交结果，显示果蝇气管发育中某种特定mRNA的表达。可见果蝇身体节段呈现清晰的重复模式，前部（头）在上面，腹部靠左。使器官和细胞在模拟体内环境的实验状况下生长，有利于探索生命的基本活动规律并获得大量的特定的细胞。（三）体外培养技术（culturetechniquesinVitro）未分化或低分化细胞的获取途径胚胎干细胞的培养培养中的人胚胎干细胞培养细胞的体外分化和应用目标细胞融合（cellfusion）又称细胞杂交（cellhybridization），是指用自然或人工的方法使两个或几个不同细胞融合为一个细胞的过程。大型细胞发酵罐气流驱动培养系统示意图组织工程皮肤的制备将细胞及其组分进行分离和纯化，用于研究某一类细胞或细胞组分的特点和功能。不同的细胞器、大分子和病毒的密度及相应的沉降系数（四）细胞及其组分的分离和纯化技术（segregationandpurificationtechniquesofcellularcomponents）等密度离心法（isodensityentrifugation）差速离心法（differentialcentrifugation）用于体积差别较大颗粒的分离，例如细胞器的初步分离。差速离心法通过一组离心速度逐渐递增的离心操作步骤使悬浮液中的各种颗粒分离开：首先用低速离心将大颗粒沉降到离心管的底部；取其上清液，再以中等速度离心，使稍大的颗粒沉降到管底；收集上清，再加以高速离心。这样依次离心使各种颗粒逐渐分离免疫磁珠技术的特异性高并能保持分离细胞的活性层析技术（chromatography）是根据蛋白质的形态、大小和电荷的差异来进行分离的方法，能纯化并获得非变性的、天然状态的蛋白质。琼脂糖电泳示意图SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳示意图流式细胞技术（flowcytometry）用荧光抗体与相应抗原结合，标定欲分离的细胞或细胞器，再通过自动化的激光/光电检测系统高速检测移动中的细胞悬液荧光，从混合的细胞群体中分选出特定的目标细胞。激光捕获显微切割技术（lasercapturemicrodissection）可从组织切片上获得目标细胞无细胞系统（cellfreesystem）（五）生物大分子的分析和鉴定技术（analysisandidentificationtechniquesofbiomacromolecules）Southern印迹技术聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是利用DNA半保留复制的原理，通过控制实验温度，使DNA处于变性、复性和合成的反复循环中，从而达到在体外快速扩增特异性DNA片段的目的。基因芯片（genechip）技术能高效和快速检测基因表达转基因技术（六）其他技术（othertechniques）体细胞核移植RNAi技术可以简便而迅速地制备特定基因缺失表型的个体，进而研究该基因的功能。RNAi技术建立的显性阴性突变A.双链RNA可以被导入到C.elegans（1）用表达双链RNA的大肠埃希菌喂食蠕虫。（2）直接把双链RNA注入到蠕虫肠道内。B.野生型蠕虫胚。C.一个蠕虫胚内与细胞分裂相关基因被双链RNA干扰失活。图中胚显示两个未融合的精子和卵子的细胞核异常位移。细胞附着的支持物微载体（microcarrier）、中空纤维（hollowfiber）、微胶囊（microcapsule）1.请说明原位杂交与免疫细胞化学技术的原理，并比较两者的联系与区别。２.何为细胞培养与细胞融合？３.请阐述流式细胞技术的原理并说明请应用特点。４.列举三种常见的显微镜技术，说明相关的原理与应用特点。思考题推荐阅读资料1.翟中和，王喜忠，丁明孝.细胞生物学.第三版.北京:高等教育出版社，20072.胡以平.医学细胞生物学.北京:高等教育出版社，20093.王金发.细胞生物学.北京:科学出版社，20034.AlbertsB,etal.MolecularBiologyoftheCell[M].5thed.NEWYORK&LONDON:GarlandPublishing,Inc,2008.CellNatureScienceEMBOAnnualReviewofCellBiologyTrendsinCellBiologyCellResearch科学通报中国科学主要期刊杂志