设计培养基的制备的实验方案

设计培养基的制备的实验方案制药1302闫敏一、实验设计思想金黄色葡萄球菌(StaphyloccocusaureusRosenbach)是人类的一种重要病原菌，隶属于葡萄球菌属（Staphylococcus）。有“嗜肉菌的别称。可引起许多严重感染。细菌按形态可分为：球菌，杆菌，和螺旋菌。金黄色葡萄球菌就是球菌的一种。它是革兰氏阳性菌的代表。革兰氏阳性菌就是可以被结晶紫初染，碘液媒染，乙醇脱色，沙黄（红色）复染后呈现紫红色的细菌。而革兰氏阴性菌则呈现红色。这些差别源于金黄色葡萄球菌具有阴性菌所没有的细胞壁结构。金黄色葡萄球菌细胞壁含90%的肽聚糖和10%的磷壁酸。相反，阴性菌没有细胞壁结构。[1]葡萄球菌属（Staphylococcus）至少包括有20个种。其中金黄色葡萄球菌是人类的一种重要病原菌，引起许多严重感染。典型的金黄色葡萄球菌为球形，直径0.8μm左右，显微镜下排列成葡萄串状。金黄色葡萄球菌无芽孢、鞭毛，大多数无荚膜，革兰氏染色阳性。是一种不利于人体的细菌。金黄色葡萄球菌营养要求不高，在普通培养基上生长良好，需氧或兼性厌氧，最适生长温度37℃，最适生长pH7.4。平板上菌落厚、有光泽、圆形凸起，直径1-2mm。血平板菌落周围形成透明的溶血环。金黄色葡萄球菌有高度的耐盐性，可在10%-15%NaCl肉汤中生长。可分解葡萄糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖，产酸不产气。甲基红反应阳性，VP反应弱阳性。许多菌株可分解精氨酸，水解尿素，还原硝酸盐，液化明胶。在干燥环境中存活数月；空气中存在，但不繁殖。耐热性强，加热70℃1h，80℃30min不被杀死；耐低温，在冷冻食品中不易死亡；耐高渗，在含有50%-66%蔗糖或15%以上食盐食品中才可被抑制，能在15%NaCl和40%胆汁中生长。金黄色葡萄球菌具有较强的抵抗力，对磺胺类药物敏感性低，但对青霉素、红霉素等高度敏感。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，广泛分布于自然界，可以引起人和动物的感染。在人体主要寄殖于鼻前庭黏膜、腹股沟、会阴部和新生儿脐带残端等部位，偶尔也寄生于口咽部、皮肤、肠道及阴道口等，是医院感染常见的病原体之一。在医院里，耐甲氧西林和其他抗生素的金黄色葡萄球菌广泛流行，对万古霉素不敏感的菌株也有所增加，给临床治疗带来了很大的困难。金黄色葡萄球菌除了引起感染外，其产生的肠毒素可污染食物而致食物中毒，为人类带来非常严重的公共卫生负担包括：原因、研究价值或意义等。二、实验目的（同综合实验）2.1学习培养基的制作过程和注意事项。2.2学习设计培养基和倒平板。2.3学习高压蒸汽灭菌过程和使用方法。2.4学习实验方案设计。三、实验基本流程（可画流程图）称药品→溶解→调pH值→融化琼脂→过滤分装→包扎标记→灭菌→摆斜面或倒平板。四、实验原理4.1微生物的营养类型光能自养型的微生物可在完全无机的环境中生长，以CO2为碳源，光做能源，无机物为供H体还原CO2合成细胞有机物质的微生物。可以直接利用光能把无机物转化成自身需要的糖类等有机物，比如蓝藻。化能自养型的微生物可以在完全无机的环境中生长发育，以无机化合物氧化为时释放的能量为能源，以CO2或碳盐为碳源，合成细胞物质的微生物。这类细菌包括硫细菌、硝化细菌、铁细菌等，硫细菌和硝化细菌与生产密切相关。所以我们的生活是依赖微生物的。对于异养型微生物：光能异养型微生物，这类微生物具有光合色素。能利用光做能源，以有机化合物为供H体，还原CO2，合成细胞物质的微生物。光能异养微生物能利用CO2，但必须在有机物存在的条件下，才能生长，人工培养还需供给生长因素。目前已用这类微生物，如红螺菌来净化高浓度有机废水，这对处理污水、净化环境，很有发展前途。化能异养型微生物，这类微生物以有机化合物为碳源，利用有机化合物氧化过程中产生的能量为能源，以有机或无机含氮化合物为氮源，合成细胞物质。由于栖息场所和摄取养料不同，可将异养微生物分为腐生型和寄生型两大类。腐生型：利用无生命的有机物获得营养物质。寄生型：从活的寄生体内获取营养物质，如病毒。中间类型（兼性腐生或兼性寄生）如结核杆菌、痢疾杆菌就是兼性寄生菌自养型微生物与异养型微生物的区别不在能否利用CO2，而在于是否以CO2为唯一或主要碳源进行生长。自养型微生物以无机碳化物为碳源，但也可能也可以利用有机物进行生长。异养型微生物虽然也可利用CO2，但必须在有机碳存在情况下。有些微生物在不同生4.2营养进入微生物的方式扩散(diffusion)原生质膜是一种半透性膜，营养物质通过原生质膜上的小孔，由高浓度的胞外环境向低浓度的胞内进行扩散。是非特异性的营养物质吸收方式。特点:在扩散过程中，营养物质的分子结构不发生变化不消耗能量,不能逆浓度运输运输,速率与膜内外物质的浓度差成正比,细胞膜的特性、膜上含水小孔的大小和形状对被扩散的营养物质分子的种类、大小有一定的选择性。物质跨膜扩散的能力和速率与物质本身的性质有关,分子量小、脂溶性、极性小的物质易通过扩散进出细胞扩散并不是微生物细胞吸收营养物质的主要方式,水是唯一可以通扩散自由通过原生质膜的分子,脂肪酸、乙醇、甘油、苯、一些气体分子(O2、CO2)及某些氨基酸在一定程度上也可通过扩散进出细胞。促进扩散易化扩散是膜蛋白介导的被动扩散。物质通过膜上的特殊蛋白质（包括载体、通道）的介导、顺电—化学梯度的跨膜转运过程，其转运方式主要有两种：一是经载体介导的易化扩散。二是经通道介导的易化扩散。单纯扩散与易化扩散都属于被动转运，被动转运的主要特点是：转运物质过程的本身不需要消耗能量易化扩散是膜蛋白介导的被动扩散。物质通过膜上的特殊蛋白质（包括载体、通道）的介导、顺电—化学梯度的跨膜转运过程，其转运方式主要有两种：一是经载体介导的易化扩散。二是经通道介导的易化扩散。单纯扩散与易化扩散都属于被动转运，被动转运的主要特点是：转运物质过程的本身不需要消耗能量，是在细胞膜上的特殊蛋白的“帮助”下，顺着浓度梯度或电位梯度进行的跨膜转运，是一个“被动”的过程。促进扩散同简单扩散相比，具有以下一些特点：①促进扩散需要膜蛋白的帮助，并且比简单扩散的速度要快几个数量级。②简单扩散的速率与溶质的浓度成正比，而膜蛋白帮助的促进扩散可以达到最大值，当溶质的跨膜浓度差达到一定程度时，促进扩散的速度不再提高。③在简单扩散中，结构上相似的分子以基本相同的速度通过膜，而在促进扩散中，运输蛋白具有高度的选择性。如运输蛋白能够帮助葡萄糖快速运输，但不帮助与葡萄糖结构类似的糖类运输。④与简单扩散不同，运输蛋白的促进扩散作用也会受到各种抑制。膜运输蛋白的运输作用也会受到类似于酶的竞争性抑制，以及蛋白质变性剂的抑制作用。主动运输是指物质逆浓度梯度，在载体的协助下，在能量的作用下运进或运出细胞的过程。Na+、K+和Ca2+等离子，都不能自由地通过磷脂双分子层，它们从低浓度一侧运输到高浓度一侧，需要载体蛋白的协助，同时还需要消耗细胞内化学反应（主要为呼吸作用）所释放的能量。钠钾泵实际上就是Na+-K+ATP酶，一般认为是由2个大亚基、2个小亚基组成的4聚体。Na+-K+ATP酶通过磷酸化和去磷酸化过程发生构象的变化，导致与Na+、K+的亲和力发生变化。在膜内侧Na+与酶结合，激活ATP酶活性，使ATP分解，酶被磷酸化，构象发生变化，于是与Na+结合的部位转向膜外侧；这种磷酸化的酶对Na+的亲和力低，对K+的亲和力高，因而在膜外侧释放Na+、而与K+结合。K+与磷酸化酶结合后促使酶去磷酸化，酶的构象恢复原状，于是与K+结合的部位转向膜内侧，K+与酶的亲和力降低，使K+在膜内被释放，而又与Na+结合。其总的结果是每一循环消耗一个ATP；转运出三个Na+，转进两个K+。钠钾泵的一个特性是他对离子的转运循环依赖自磷酸化过程，ATP上的一个磷酸基团转移到钠钾泵的一个天冬氨酸残基上，导致构象的变化。通过自磷酸化来转运离子的离子泵就叫做P-type，与之相类似的还有钙泵和质子泵。它们组成了功能与结构相似的一个蛋白质家族。Na+-K+泵作用是：①维持细胞的渗透性，保持细胞的体积；②维持低Na+高K+的细胞内环境，维持细胞的静息电位，同时也是动作电位的基础。乌本苷（ouabain）、地高辛（digoxin）等强心剂能抑制心肌细胞Na+-K+泵的活性；从而降低钠钙交换器效率，使内流钙离子增多，加强心肌收缩，因而具有强心作用。钙离子泵钙离子泵对于细胞是非常重要的，因为钙离子通常与信号转到有关，钙离子浓度的变化会引起细胞内信号途径的反应，导致一系列的生理变化。通常细胞内钙离子浓度（10-7M）显著低于细胞外钙离子浓度（10-3M），主要是因为质膜和内质网膜上存在钙离子转运体系，细胞内钙离子泵有两类：其一是P型离子泵，其原理与钠钾泵相似，每分解一个ATP分子，泵出2个Ca2+。另一类叫做钠钙交换器（Na+-Ca2+exchanger），属于反向协同运输体系（antiporter），通过钠钙交换来转运钙离子。位于肌质网（sarcoplasmicreticulum）上的钙离子泵是了解最多的一类P型离子泵，占肌质网膜蛋白质的90%。肌质网是一类特化的内质网，形成网管状结构位于细胞质中，具有贮存钙离子的功能。肌细胞膜去极化后引起肌质网上的钙离子通道打开，大量钙离子进入细胞质，引起肌肉收缩之后由钙离子泵将钙离子泵回肌质网。质子泵质子泵有三类：P-type、V-type、F-type。1、P-type：载体蛋白利用ATP使自身磷酸化（phosphorylation），发生构象的改变来转移质子或其它离子，如植物细胞膜上的H+泵、动物细胞的Na+-K+泵、Ca2+离子泵，H+-K+ATP酶（位于胃表皮细胞，分泌胃酸）。2、V-type：位于小泡（vacuole）的膜上，由许多亚基构成，水解ATP产生能量，但不发生自磷酸化，位于溶酶体膜、动物细胞的内吞体、高尔基体的囊泡膜、植物液泡膜上。3、F-type：是由许多亚基构成的管状结构，H+沿浓度梯度运动，所释放的能量与ATP合成耦联起来，所以也叫ATP合酶（ATPsynthase），F是氧化磷酸化或光合磷酸化偶联因子（factor）的缩写。F型质子泵位于细菌质膜，线粒体内膜和叶绿体的类囊体膜上。F型质子泵不仅可以利用质子动力势将ADP转化成ATP，也可以利用水解ATP释放的能量转移质子。ABC转运器ABC转运器（ABCtransporter）最早发现于细菌，是细菌质膜上的一种运输ATP酶（transportATPase），属于一个庞大而多样的蛋白家族，每个成员都含有两个高度保守的ATP结合区（ATPbindingcassette），故名ABC转运器，他们通过结合ATP发生二聚化，ATP水解后解聚，通过构象的改变将与之结合的底物转移至膜的另一侧。在大肠杆菌中78个基因（占全部基因的5%）编码ABC转运器蛋白，在动物中可能更多。虽然每一种ABC转运器只转运一种或一类底物，但是其蛋白家族中具有能转运离子、氨基酸、核苷酸、多糖、多肽、甚至蛋白质的成员。ABC转运器还可催化脂双层的脂类在两层之间翻转，这在膜的发生和功能维护上具有重要的意义。第一个被发现的真核细胞的ABC转运器是多药抗性蛋白（multidrugresistanceprotein,MDR），该基因通常在肝癌患者的癌细胞中过表达，降低了化学治疗的疗效。约40%的患者的癌细胞内该基因过度表达。ABC转运器还与病原体对药物的抗性有关，如临床常用的抗真菌药物有氟康唑、酮康唑、伊曲康唑等，真菌对这些药物产生耐药性的一个重要机制是通过MDR蛋白降低了细胞内的药物浓度。协同运输协同运输（cotransport）是一类靠间接提供能量完成的主动运输方式。物质跨膜运动所需要的能量来自膜两侧离子的电化学浓度梯度，而维持这种电化学势的是钠钾泵或质子泵。动物细胞中常常利用膜两侧Na+浓度梯度来驱动，植物细胞和细菌常利用H+浓度梯度来驱动。根据物质运输方向与离子沿浓度梯度的转移方向，协同运输又可分为：同向协同（symport）与反向协同（antiport）。1、同向协同同向协同（symport）指物质运输