生物化学技术原理与应用全套课件443p

生物化学技术原理及应用1第一章生命大分子物质的制备第一节材料的选择与处理第二节确定测定方法第三节细胞的破碎第四节抽提第五节浓缩第六节纯化方案的设计与评价第七节有效成分纯度和性质的分析第八节应用实例2一、材料的选择有效成分：指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。有效成分具有含量少和稳定性差的特性。材料选择原则(1)含量多、稳定性好；(2)来源丰富、保持新鲜；(3)工艺简单、有利用价值。3二、材料的处理1、动物脏器：(1)冰冻：短时间零下10℃冰库或零下70℃低温冰箱（数月）贮存；(2)脱脂：人工剥离；有机溶剂；快冷快热；脂肪分离器；(3)干燥：丙酮中脱水；沸水中蒸煮烘干。42、植物组织：(1)叶片：水洗净或在10小时内置零下4℃到零下30℃冰箱贮藏备用;(2)种子：泡胀或粉碎。53、微生物：(1)胞内活性分子：离心法收集上清液，低温下短时间贮存;(2)胞外活性分子：经破细胞膜处理后提取，制成冻干粉。6第二节确定测定方法一、目的和要求二、常用的测定方法7一、目的和要求确定的方法简单、灵敏、需时少、专一性8二、常用的测定方法1.光谱法(1)吸收光谱法（absorptionspectrophotometry)①直接测定法：将待测物配制成一定浓度的溶液移至分光光度计，读取吸光度。吸光度与待测物浓度成正比。例如：总蛋白含量的测定。②比色法（间接法）：将待测物与相关试剂或酶的底物作用后，移至分光光度计，读取吸光度。例如：酶活性的测定。9(2)荧光光谱法(fluo-spectrophotometry)激发光激发待测物质发射发射光，读取荧光强度。荧光强度与待测物质浓度成正比。荧光光谱法的精确性、重复性和灵敏度比吸收光谱法好。例如：乙醇中蒽的测定。10(3)浊度法极稀的悬浮液采用此法，测定悬浮液在不被吸收的波长下表现的消光值。112.电化学法有些反应可放出质子氢，可用PH计或NaOH滴定等方法追踪变化计算出待测物的含量。123.生物活性检测法细胞或动物摄入待测物质后，待测物质摄入量与细胞或动物的生理指标变化有相关性，以此检测待测物质含量。134.免疫分析法利用抗原与抗体的特异性反应，并结合生物标记，可对待测物质进行定量定性分析。145.生物传感器用生物传感器中的敏感膜与待测物质反应，可通过显示器反映有效成分的含量。1516l/nmlogeloge1loge2lmax2lmax117第三节细胞的破碎1.物理方法2.化学处理3.生物方法181.物理方法（1）研磨法：研钵，匀浆器（2）捣碎法：捣碎器（3）超声波法：超声仪（4）压榨法:挤压（5）冻融法：低温冷冻迅速取出192.化学处理（1）脂溶性溶剂：丙酮；氯仿；甲苯（2）表面活性剂：十二烷甲基黄酸钠；十二烷基硫酸钠203.生物方法（1）溶胀（2）自溶（3）生物酶降解：溶菌酶；蛋白水解酶K21第四节抽提一.抽提的含义二.抽提有效成分的影响因子22一、抽提的含义用适当的溶剂和方法，从原料中把有效成分分离出来的过程。用缓冲液，稀酸，稀碱或有机溶剂（丙酮，乙醇）等抽提，有时还可以用蒸馏水抽提。23二.抽提有效成分的影响因子1.PH值2.溶剂的极性和离子强度3.水解酶4.温度：选择合适的抽提温度5.搅拌：温和搅拌可增加溶解度6.氧化7.金属离子8.抽提液与抽提物的比例:1:5241.PH值对蛋白质或酶等具有等电点的两性电解质物质，选择抽提液的PH值在偏离等电点。252.溶剂的极性和离子强度有些蛋白质或酶在极性大、离子强度大的溶液中稳定，有些则相反加入蔗糖、甘油、DMSO降低溶液极性加入KCL、NaCL、NH4CL升高溶液离子强度263.水解酶为防止酶与欲抽提的蛋白质或核酸发生反应，采取以下措施：(1)加入PMSF等酶抑制剂；(2)调节抽提液的极性、离子强度和PH值。276.氧化一般蛋白质或酶含有必需集团巯基，若抽提液中存在氧化剂或氧分子时，会使巯基形成分子内或分子间二硫键，导致蛋白质变性。为此，常加入2-巯基乙醇、半胱氨酸还原剂。植物组织和微生物细胞中含酚类物质，在多酚氧化酶作用下，可变为有色的醌类物质。加入苯基硫脲，可抑制这一反应。287.金属离子蛋白质的巯基还能与源于缓冲液金属离子铅、铁、铜作用，产生沉淀。解决办法：无离子水配制缓冲液加入1-3mMEDTA2930第五节浓缩一.沉淀法二.吸附法三.超过滤法四.透析法五.减压蒸馏法六.冰冻干燥法31一.沉淀法抽提液中加入适量的中性盐如硫酸氨或有机溶剂,使有效成分沉淀，离心除去不溶物，获得上清透析或层析柱去盐。32二.吸附法干葡聚糖凝胶G25或吸水棒加入抽提液，两者比例一比五，能缩小抽提液体积三倍左右.33三.超过滤法在空气或氮气压力下，使小分子物质通过半透膜而大分子物质留在膜内的装置。34四.透析法（1）把装透析液的透析袋埋在吸水力强的聚乙二醇PEG或甘油中；（2）真空透析。35五.减压蒸馏法简易减压蒸馏装置（降低沸点）.36六.冰冻干燥法冰冻的抽提液在真空状态下，可由固体直接变为气体。373839第六节纯化方案的设计与评价一.纯化方案的设计二.纯化方案的评价40一.纯化方案的设计纯化的总原则：考虑抽提液中有效成分与杂质的理化性质差异，几种方法组成一个科学合理的纯化方案切忌：一种方法重复使用41二.纯化方案的评价考察比活力、纯化倍数和收得率42第二编纯化方法第二章沉淀法第三章吸附层析第四章疏水层析第五章离子交换层析第六章凝胶过滤第七章亲和层析第八章聚焦层析第九章高效液相色谱第十章固定化的酶与微生物43第二章沉淀法第一节基本原理与沉淀类型第二节应用实例44第一节基本原理与沉淀类型一、基本原理二、制备蛋白质三、制备核酸45一、基本原理根据各种物质结构不同，改变溶质的性质，致使抽提液有效成分溶解度变化。46二、制备蛋白质1.盐析法2.有机溶剂沉淀法3.蛋白质沉淀法4.聚乙二醇沉淀法5.选择性沉淀法6.结晶沉淀法471.盐析法(1)盐分级沉淀(2)盐析曲线制作(3)盐析的影响因子(4)脱盐48(1)盐分级沉淀①盐的选择：常选用硫酸铵②硫酸铵盐析A.固体法：逐步加入固体硫酸铵，当加到一定的饱和度时，蛋白质便可沉淀出来。B.饱和溶液法：逐步加入预先调好pH值的饱和硫酸铵，蛋白质便可沉淀出来。C.透析法：透析袋放入一定浓度的大体积溶液中，通过透析作用来改变蛋白质溶液中的盐浓度，沉淀蛋白质。49(2)盐析曲线制作硫酸铵饱和度%VS蛋白质沉淀%50(3)盐析的影响因子①盐析常数②盐分级范围的差异性③PH和盐浓度④蛋白质的纯度和浓度⑤其它51①盐析常数lgS=beta-KsXM其中，S表示蛋白质的溶解度，M表示溶液中盐的浓度。盐析常数Ks值大，意味着蛋白溶解度减低速度随着盐浓度增加而快速降低。52②盐分级范围的差异性当分离两种以上蛋白质时，若每一种蛋白质的的Ks值都大，而且盐析范围差异明显，则分离效果好。53④蛋白质的纯度和浓度一般控制样品液蛋白质浓度在0.2%-2%为宜。54⑤其它有时需在溶液中加1mM的EDTA盐，除金属离子硫酸铵沉淀时间控制好，一般在2h左右55(4)脱盐：凝胶过滤法和透析法透析法注意事项①透析带处理：用蒸馏水洗净，检查无漏洞②透析液选择：一般为低离子强度中性缓冲液③掌握透析时间：搅拌，样品液与透析液体积比为1：10，3h.562.有机溶剂沉淀法基本原理：与盐溶液一样具有脱水作用；有机溶剂介电常数比水小，使溶剂极性减小注意事项(1)低温下操作防止有机溶剂的放热使蛋白变性(2)中性盐作用增加蛋白质溶解度，防变性(3)多价阳离子作用结合蛋白质，致其溶解度降低573.蛋白质沉淀法盐沉淀法和有机溶剂沉淀法可以沉淀很多蛋白质，但是蛋白质沉淀法则仅对一类或一种蛋白质起作用。常用碱性蛋白质、凝集素和重金属离子。584.聚乙二醇沉淀法聚乙二醇和右旋糖酐硫酸钠等水溶性非离子型聚合物可使蛋白质发生沉淀作用。595.选择性沉淀法根据各种蛋白质在不同物理化学因子作用下稳定性不同的热点，用选择性沉淀法，即可使杂蛋白变性沉淀，而欲分离的有效成分则存在于溶液中，从而达到纯化有效成分的目的。606.结晶沉淀法蛋白质沉淀可分为晶体沉淀和无定形沉淀两类，前者分子排列有规则，后者分子排列无规则在提纯阶段，当某一蛋白质浓度达到5%-30%水平时，只要条件合适，就能产生一一定形状的晶体61三、制备核酸1.DNA/RNP复合物的解聚2.多糖等杂质的消除3.核酸沉淀621.DNA/RNP复合物的解聚通常使DNA/RNP复合物有效解聚的办法，主要是采用加入去污剂、有机溶剂和蛋白水解酶等试剂加以实现。(1)去污剂:SDS、DOC、NP40、TritonX-100(2)有机溶剂:苯酚、氯仿（注意事项P34）(3)蛋白水解酶：溶菌酶、蛋白酶E/K632.多糖等杂质的消除(1)多糖(2)DNA与RNA的分离64(1)多糖动物材料分离多糖，处理前饥饿12h植物材料分离多糖，处理前暗室培养数天核酸分离液中多糖，使用选择性沉淀剂65(2)DNA与RNA的分离①盐析：NaCL分离DNA和RNA②酶水解法：提取DNA时，可用RNase;反之，可用DNase66在核酸溶液中加入某些有机溶剂和非离子型聚合物等试剂时，核酸会被有效沉淀出来。(1)有机溶剂：乙醇-盐溶液、乙丙醇(2)聚乙二醇(3)CTAB3.核酸沉淀67第二节应用实例一、皮磷酸二酯酶的纯化二、细菌染色体DNA的制备68一、皮磷酸二酯酶的纯化1.制备丙酮粉2.第一次硫酸铵分级3.第二次硫酸铵分级4.丙酮分级分离69第三章吸附层析吸附层析又称色层法或色谱法。按流动相分类，有液相层析和气相层析；按固定相床的形式分类，柱层析、薄层层析、薄膜层析等。按原理不同可分为：第一节吸附柱层析第二节薄层层析第三节聚酰胺薄层层系70第一节吸附柱层析一、常用术语二、基本原理三、吸附剂四、洗脱剂五、层析柱的制备与层析操作六、应用与实例71一、常用术语1.固定相2.流动相3.层析4.操作容量5.床体积（Vt）6.洗脱体积（Ve）7.外水体积（Vo）8.内水体积（Vi）9.基质体积（Vg）10.膨胀度11.分配系数和迁移率72固定相是由层析基质组成的物质，包括固体物质（吸附剂、离子交换剂）和液体物质（固定在纤维素或硅胶上的溶液）。这些物质与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用。73在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体称为流动相。又称洗脱剂或洗涤剂，在薄层层析中称展层剂。74以基质为固定相，以液体或气体为流动相，有效成分和杂志在这两个相中连续多次地进行分配、吸附或交换作用，最终结果是使混合物得到分离。75在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克（或毫升）基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。数值大，结合力强；数值小，结合力弱。76膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积（Vt）：Vt=Vo+Vi+Vg77某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大时的流动相体积。78外水体积指基质颗粒之间体积的总和。79内水体积是指基质颗粒内部体积的总和。80基质体积是指基质自身所具有的体积。Vo、Vi、Vg都是随着床体积和基质性质变化而变化的。81每克溶胀基质所具有的床体积。一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大。82分配系数：一组分在固定相与流动相中含量的比值（K）。迁移率：一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比。K值大，说明该组分与固定相结合力大，迁移率小；反之则结合力小，迁移率大。83二、基本原理在吸附层析法中，使用的固定相基质是颗粒状的吸附剂。在吸附剂的表面存在着许多随机分布的吸附位点，这些位点通过范德瓦尔力和静电引力与蛋白质和核酸等生物大分子结合。结合力大小与生物分子结构和和吸附剂的性质有密切关系。84三、吸附剂1.吸附剂的选择2.吸附剂的性质85应具备：表面积大、颗粒均匀、吸附选择性好、稳定性强、成本低。极性强的吸附剂易吸附极性强的物质，非极性吸附剂易吸附非极性物质。但是为了解吸附，对于极性大的分离物，应选择极性小的吸附剂。86使用前预处理：过筛除