微生物课件(周德庆)第七章Part 3 基因重组和杂交育种

第三节第三节基因重组和杂交育种基因重组和杂交育种PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建定义:把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新遗传型个体的方式，称为基因重组或遗传重组。重组可使生物体在未发生突变的情况下，也能产生新遗传型的个体。u重组与杂交的关系：重组是分子水平上的一个概念，可以理解成是遗传物质分子水平上的杂交。而一般所说的杂交则是细胞水平上的一个概念。杂交中必然包含着重组，而重组则不限于杂交这一种形式。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建一、原核微生物的基因重组一、原核微生物的基因重组u转化u转导u接合u原生质体融合PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建（一）转化（一）转化1、转化及其发现R型活菌+S型死菌→S型活菌u定义：受体菌在自然或人工技术作用下直接摄取来自供体菌的游离DNA片段，并把它整合到自己的基因组中，而获得部分新的遗传性状的基因转移过程，称为转化。转化后的的受体菌称为转化子。u有关名词：受体菌：转化基因的接受者供体菌：转化基因的提供者转化因子：来自供体菌的DNA片段转化子：将转化基因重组进入自身染色体组的重组子PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建受体细胞要处于感受态感受态：受体细胞能从环境吸取外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态。u供体DNA片段（转化因子）大小适宜：分子量一般为1×107D左右。u菌株间的亲缘关系密切：两个菌种或菌株之间能否发生转化，与它们在进化过程中的亲缘关系有着密切的关系。但即使在转化率极高的菌种中，其不同菌株间也不一定都能发生转化。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建感受态：感受态：u出现时间：只在细菌生长的某一时期出现；不同菌种的感受态出现在不同生长时期。u感受态由细胞的遗传性决定，但同时也受环境因子的影响：cAMP、Ca2+等最明显。如用CaCl2处理E.coli可以诱发其产生感受态。u感受态细胞的比例：当处于感受态高峰时，群体中呈感受态的细胞因菌种而不同。u转化DNA的最低浓度：在群体中含有15%感受态细胞时，0.1mgDNA/ml细胞悬液即可有效发生转化。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建转化因子：转化因子：u本质是供体DNA片段u一般的转化因子都是线状双链DNA；也有少数报道认为线状单链DNA也有转化作用。u大小：经过多次提纯操作后，每一转化DNA片段的分子量都小于1×107，即约占细菌核染色体组的0.3%，其上平均约含15个基因。而粗制的DNA则分子量较大。u吸收数量：每个感受态细胞约可掺入10个转化因子。u转化频率：一般只有0.1-1%，最高时亦达10%左右。据研究，呈质粒形式（双链闭合环状）的转化因子，其转化频率最高（因为它进入受体菌中后，可不必与受体染色体进行交换、整合即可进行复制和表达）。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建吸附：双链DNA片段与细胞表面的特定位点结合，此时，细胞膜上的胆碱可促进这一过程。u切割：在吸附位点上的DNA被核酸内切酶分解，形成平均分子量为4~5×106的DNA片段；u入胞：DNA双链中的一条单链被膜上的另一种核酸酶切除，另一条单链逐步进入细胞，这是一个耗能的过程。分子量小于5×105的DNA片段不能进入细胞。这时如用低浓度溶菌酶处理，可提高细胞壁的通透性，故可提高转化频率；u重组：来自供体菌的单链DNA片段在细胞内与受体细胞核染色体组上的同源区配对，接着受体染色体组上的相应单链片段被切除，并被外来的单链DNA交换、整合和取代，于是形成了一个杂合DNA区段。u复制：受体菌的染色体组进行复制，杂合区段分离成两个，其中之一获得了供体菌的转化基因，另一个未获供体基因；u转化子形成：当细胞发生分裂后，一个子细胞含供体基因，这就是转化子；另一个细胞与原始受体菌一样。以肺炎链球菌抗链霉素菌株为例，大致可分为六阶段：PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建~5×106单链入胞同源部分配对、整合复制分裂，只有一个子代DNA分子获得供体基因非转化子转化子转化过程PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建人工转化根据感受态建立的方式，可以分为两种：PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建自然遗传转化自然遗传转化到目前为止，已发现能发生转化作用的菌属主要有：uStreptococcuspneumoniae、Haemophilus（嗜血杆菌属）、Bacillus、Neisseria（奈瑟氏球菌属）、Rhizobium（根瘤菌属）、Staphylococcus、Pseudomonas和Xanthomonas中多见。u在若干放线菌和蓝细菌以及Saccharomycescerevisiae、Neurosporacrassa（粗糙脉胞菌）和Aspergillusniger中，也有转化现象。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建定义：是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取DNA的能力，或人工地将DNA导入细胞内。u方法：①CaCl2处理细胞，使其成为能摄取外源DNA的感受态状态。②电穿孔法：用高压脉冲电流击破细胞膜，或击成小孔，使各种大分子（包括DNA）能通过这些小孔进入细胞。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建定义：u把噬菌体或其它病毒的DNA（或RNA）抽提出来，让它去感染感受态的宿主细胞，并进而产生正常的噬菌体或病毒的后代，这种现象称为转染（transfection）。u与转化的区别：u病毒或噬菌体并非遗传基因的供体菌u中间不发生任何遗传因子的交换或整合u最后不产生具有杂种性质的转化子PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建（二）转导（（二）转导（transductiontransduction））u定义：以完全缺陷或部分缺陷噬菌体为媒介，将供体细胞的DNA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，称转导子。由J.Lederberg等（1952）在Salmonellatyphimurium（鼠伤寒沙门氏菌）中发现的。u存在：自然界中比较普遍，它在低等生物的进化中，很可能是一种产生新基因组合的重要方式。1.定义与存在：PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建噬菌体裂解一个宿主细胞时可能有三种情况：噬菌体裂解一个宿主细胞时可能有三种情况：u包入的完全是噬菌体的DNA（正常噬菌体）u包入的完全是细菌DNA（完全缺陷噬菌体）u包入部分带有噬菌体基因的DNA（部分缺陷噬菌体）转导分别是由后两种噬菌体参与进行的。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建定义：通过完全缺陷噬菌体对供体菌任何DNA小片段的“误包”而实现其遗传性状传递至受体菌的转导现象，称为普遍性转导。u普遍转导又可分为两种：u完全普遍转导u流产普遍转导PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建中存在转导现象。u以其野生型菌株作为供体菌u营养缺陷型菌株作为受体菌uP22噬菌体作为转导媒介，对供体菌是烈性噬菌体，对受体菌是温和噬菌体。过程：供体菌正常噬菌体+完全缺陷噬菌体少量裂解物+大量受体菌遗传稳定的转导子裂解PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建在供体菌内增殖时，宿主的核染色体组断裂，待噬菌体成熟与包装之际，极少数（10–6~10–8）噬菌体的衣壳将与噬菌体头部核心大小相似的一段供体DNA片段误包入其中，形成了一个完全不含噬菌体自身DNA的缺陷噬菌体。u供体菌裂解时，如把少量裂解物与大量受体菌群体相混，使其感染复数（m.o.i）1，这种完全缺陷噬菌体就会将这一外源DNA片段导入受体细胞内。u在这种情况下，由于一个受体细胞只感染了一个完全缺陷噬菌体，故受体细胞不会发生往常的溶原化，也不显示其免疫性，更不会裂解和产生正常的噬菌体；而由于导入的外源DNA片段可与受体细胞核染色体组上的同源区段配对，在通过双交换而整合到受体菌染色体组中，所以使后者成为一个遗传性状稳定的转导子。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建概念：受体菌经转导获得的供体DNA片段在受体菌中不发生配对、交换和整合，也不迅速消失，而只是进行转录和转译（性状表达），这种现象就称为流产转导。u现象：发生流产转导的细胞在其进行细胞分裂后，只能将这段外源DNA分配给一个子细胞，而另一子细胞仅获得供体基因的产物——酶，在表型上表现出轻微的供体菌特征，每经过一次分裂，就受到一次稀释，所以，能在选择性培养基平板上形成微小菌落就是流产转导的特点。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建定义：通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。u特点：u噬菌体对供体菌和受体菌都是温和噬菌体u只能转导供体菌的个别特定基因（一般为噬菌体整合位点两侧的基因）u该特定基因由部分缺陷的噬菌体携带u分类：低频转导与高频转导PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建局限性转导的过程局限性转导的过程Ø该溶源菌被诱导裂解时，有极少数的前噬菌体发生不正常切离，其结果会将插入位点两侧之一的少数宿主基因（如E.colil前噬菌体的两侧分别为发酵半乳糖的gal基因或合成生物素的bio基因）连接到噬菌体DNA上（而噬菌体也将相应的一段DNA遗留在宿主的染色体组上），通过衣壳的“误包”，就形成了一种特殊的噬菌体——缺陷噬菌体（defectivephage）。它们没有将宿主溶源化的能力，而是使宿主成为一个局限转导子，对l噬菌体没有免疫性。Ø温和噬菌体感染受体菌后，其DNA会开环，以线状形式整合到宿主染色体的特定位点上，从而使宿主细胞发生溶源化，并获得对相同温和噬菌体的免疫性。PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建一般的转导现象中，从宿主染色体上切离时发生不正常切离的频率极低，故这种裂解物中的部分缺陷噬菌体的比例是极低的（10–4~10–6）。把这种裂解物称为LFT（低频转导）裂解物。u用LFT裂解物以低m.o.i（感染复数）感染宿主，就可获得极少量的局限转导子，即低频转导PDF文件使用pdfFactoryPro试用版本创建高频转导高频