蛋白质组学及其研究方法与进展

蛋白质组学及其研究方法与进展蛋白质是生命活动的体现者，基因的表达最后是通过蛋白质来体现的，在这个过程中，蛋白质起了连接基因与表现的功能。蛋白质是有氨基酸组成的，组成蛋白质的氨基酸的种类及排列顺序构成了蛋白质的一级结构，而在一级机构基础上的多肽链本身的折叠和盘绕方式构成了蛋白质的二级结构，考虑到多肽链上原子在空间的分布，由二级结构进一步形成了蛋白质的三级结构，对于有多个亚基的蛋白质还存在四级结构。蛋白质的一级结构决定了高级结构，而高级结构则决定着蛋白质的生物学功能。如今对于蛋白质研究已经单独形成了一个活跃的生物学分支学科―――蛋白质组学，在蛋白质的研究中发挥着很重要的作用，下面将介绍蛋白质组学的一些基本内容及研究进展。一.产生背景[1]在20世纪中后期随着DNA双螺旋结构的提出和蛋白质空间结构的解析，生命科学研究进入了分子生物学时代，对遗传信息载体DNA和生命功能的体现者蛋白质的研究，成为了其主要内容。90年代初期启动的庞大的人类基因组计划．在经过各国科学家多年的努力下，已经取得了巨大的成就。10多种低等模式生物的基因组序列测定L三完成；第一个多细胞生物一线虫基因组的DNA全序列测定也在1998年年底完成；人类所有基因的部分序列测定(EST)已经完成；人类基因组的全序列测定有可能提前到2003年完成。生命科学已跨入了后基因组时代。在后基因组时代，研究重心将从揭示生命的所有遗传信息转移到在整体水平上对功能的研究。这种转向的第一个标志是产生了功能基因组学这一新学科，即从基因组整体水平上对基因的活动规律进行阐述。如在mRNA水平上，通过DNA芯片(DNAchips)和微阵列(Microarray)法等技术检测大量基因的表达模式，并取得了很好的进展。但是，mRNA的表达水平(包括mRNA的种类和含量)由于mRNA储存和翻译调控以及翻译后加工等的存在．并不能直接反映蛋白质的表达水平}蛋白质自身特有的活动规律，如蛋白质的修饰加工、转运定位结构形成、代谢、蛋白质与蛋白质及其他生物大分子的相互作用等．均无法从在基因组水平上的研究获知。因此，对生物功能的主要体现者或执行者一蛋白质的表达模式和功能模式的研究就成为生命科学发展的必然。在此背景下．80年代中期，国际上葫发了一门研究细胞内垒部蛋白质的组成及其活动规律的新兴学科-蛋白质组学(Proteomic)。蛋白质组(proteome)一词是马克.威尔金斯(MarcWilkins)最先提出来的,最早见诸于1995年7月的“Electrophoresis”杂志上它是指一个有机体的全部蛋白质组成及其活动方式。蛋白质组研究虽然尚处于初始阶段,但已经取得了一些重要进展。当前蛋白质组学的主要内容是,在建立和发展蛋白质组研究的技术方法的同时,进行蛋白质组分析。对蛋白质组的分析工作大致有两个方面。一方面,通过二维凝胶电泳得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱,相关数据将作为待检测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。一系列这样的二维参考图谱和数据库已经建立并且可通过联网检索。二维参考图谱建立的意义在于为进一步的分析工作提供基础。蛋白质组分析的另一方面,是比较分析在变化了的生理条件下蛋白质组所发生的变化。如蛋白质表达量的变化,翻译后修饰的变化,或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上的定位的改变等。细胞或组织的蛋白质不是杂乱无章的混合物,蛋白质间的相互作用、相互协调是细胞进行一切代谢活动的基础。蛋白质间的相互作用及作用方式同样也是蛋白质组研究所面临的问题。研究蛋白质间的相互作用有多种方法,常用的如酵母双杂交系统、亲和层析、免疫沉淀、蛋白质交联等。其中,酵母双杂交系统是当前发展迅速、应用广泛的主要方法。二.发展趋势[2]国际上蛋白质组研究进展十分迅速，不论基础理论还是技术方法，都在不断进步和完善。相当多种细胞的蛋白质组数据库已经建立，相应的国际互联网站也层出不穷。1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心：AustraliaProteomeAnalysisFacility(APAF)。丹麦、加拿大、日本也先后成立了蛋白质组研究中心。在美国，各大药厂和公司在巨大财力的支持下，也纷纷加入蛋白质组的研究阵容。去年在瑞士成立的GeneProt公司，是由以蛋白质组数据库“SWISSPROT”著称的蛋白质组研究人员成立的，以应用蛋白质组技术开发新药物靶标为目的，建立了配备有上百台质谱仪的高通量技术平台。而当年提出HumanProteinIndex的美国科学家NormsnG.Anderson也成立了类似的蛋白质组学公司，继续其多年未实现的梦想。2001年4月，在美国成立了国际人类蛋白质组研究组织(HumanProteomeOrganization,HUPO),随后欧洲、亚太地区都成立了区域性蛋白质组研究组织，试图通过合作的方式，融合各方面的力量，完成人类蛋白质组计划(HumanProteomeProject)。三.研究技术[7]1用于分离的双向电泳(2-DE)蛋白质组研究的发展以双向电泳技术作为核心.双向电泳由O’Farrell’s于1975年首次建立并成功地分离约1000个E.coli蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化.双向电泳原理简明，第一向进行等电聚焦，蛋白质沿pH梯度分离，至各自的等电点；随后，再沿垂直的方向进行分子量的分离.目前，随着技术的飞速发展，已能分离出10000个斑点(spot).当双向电泳斑点的全面分析成为现实的时候，蛋白质组的分析变得可行.样品制备(sampleprepareation)和溶解同样事关2-DE的成效，目标是尽可能扩大其溶解度和解聚，以提高分辨率.用化学法和机械裂解法破碎以尽可能溶解和解聚蛋白，两者联合有协同作用.对IEF(isoelectricfocusing)样品的预处理涉及溶解、变性和还原来完全破坏蛋白间的相互作用，并除去如核酸等非蛋白物质.理想的状态是人们应一步完成蛋白的完全处理.近来，在“变性剂鸡尾酒”中，含14～16个碳的磺基甘氨酸三甲内盐(ASB14～16)的裂解液效果最好.而离液剂2mol/L硫脲和表面活性剂4%CHAPS的混合液促使疏水蛋白从IPG(immobilizedpHgradients)胶上的转换.三丁基膦(Tributylphosphine，TBP)取代β-巯基乙醇或DTT完全溶解链间或链内的二硫键，增强了蛋白的溶解度，并导致转至第二向的增加.两者通过不同的方法来增加蛋白的溶解度，作为互补试剂会更有效.在保持样品的完整性的前提下，可利用超离和核酸内切酶去除核酸(DNA).除此之外，机械力被用来对蛋白分子解聚，如超声破碎等.另外，添加PMSF等蛋白酶抑制剂，可保持蛋白完整性.由于商品化的IPG胶条是干燥脱水的，可在其水化的过程中加样，覆盖整个IPG胶，避免在样品杯中的沉淀所致的样品丢失.此外，低丰度蛋白(lowabundanceprotein)在细胞内可能具有重要的调节功能，代表蛋白质组研究的“冰山之尖”，故分离低丰度蛋白是一种挑战.亚细胞分级和蛋白质预分级、提高加样量(已达到1～15mg级的标准)、应用敏感性检测，可以提高其敏感性.如一种多肽免疫2-DE印迹(MI-2DE)是利用几种单克隆抗体技术来分析和检测.提高组蛋白和核糖体蛋白等碱性蛋白(basicproteins)的分离是另一难点.由于碱性pH范围内凝胶基质的不稳定及逆向电渗流(EOF)的产生，对PI(等电点)超过10的碱性蛋白，通过产生～的山梨醇梯度和16%的异丙醇可减少之.亦可用双甲基丙烯酰胺来增加基质的稳定性.2-DE面临的挑战是高分辨率和重复性.高分辨率确保蛋白最大程度的分离，高重复性允许进行凝胶间配比(match).对2-DE而言，有3种方法分离蛋白：1)ISO-DALT(isoelectricfocus)以O’Farrell’s技术为基础.第一向应用载体两性电解质(carrierampholyte,CA)，在管胶内建立pH梯度.随着聚焦时间的延长，pH梯度不稳，易产生阴极漂移.2)NEPHGE(non-equilibriumpHgradientelectrophoresis)用于分离碱性蛋白(pH7.0).如果聚焦达到平衡状态，碱性蛋白会离开凝胶基质而丢失.因此，在等电区域的迁移须在平衡状态之前完成，但很难控制.3)IPG-DALT发展于80年代早期.由于固相pH梯度(ImmobilizedpHgradient,IPG)的出现解决了pH梯度不稳的问题.IPG通过immobiline共价偶联于丙烯酰胺产生固定的pH梯度，克服了IEF的缺点，从而达到高度的重复性.目前可以精确制作线性、渐进性和S型曲线，范围或宽或窄的pH梯度.新的酸性pH3～5或碱性pH6～11的IPG凝胶梯度联合商品化的pH4～7的梯度可对蛋白质形成蛋白质组重叠群(proteomiccontigs)从而有效分离.分离后的斑点检测(spotdetection)亦很重要.所采用的检测策略和分离后所采用的方法的相互作用是很重要的.此外，还需考虑反应的线性、饱和阈/动态范围、敏感性、对细胞蛋白群的全体定量分析的适应性、可行性.目前，没有一种蛋白染色覆盖广泛的浓度和PI及分离后分析技术.银染已成为一种检测2-DE的流行方法，可检测少到2～5ng的蛋白，因此较考马斯亮蓝R-250敏感.多数糖蛋白不能被考马斯亮蓝染色，一些有机染料不适于PVDF膜.放射性标记不依赖其代谢的活性，并仅适于对合成的蛋白质检测.另有一种改良的2-DE(差异凝胶电泳)，即应用两种不同的染料荧光标记两个样品，使在同一凝胶上电泳后的凝胶图象为两个，避免了几种2-DE的比较，可在纳克级进行检测.较早期相比，2-DE有两个主要的进步：首先，极高的重复性使有机体的参考图谱，可通过Internet获得，来比较不同组织类型、不同状态的基因表达；其次，高加样量使得2-DE成为一项真正的制备型技术.2鉴定技术(Identification)如果目前分离蛋白质组的最好技术是2-DE，那么随之而来的挑战是数百数千个蛋白如何被鉴定.在这里，我们不考虑传统的蛋白鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达.并不是因为这些方法无效，而是因为它们通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选.目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序；进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术.(1)图象分析技术(Imageanalysis).“满天星”式的2-DE，那么随之而来的挑战是数百数千个蛋白如何被鉴定.在这里，我们不考虑传统的蛋白鉴定方法，如免疫印迹法、内肽的化学测序、已知或未知蛋白的comigration分析，或者在一个有机体中有意义的基因的过表达.并不是因为这些方法无效，而是因为它们通常耗时、耗力，不适合高流通量的筛选.目前，所选用的技术包括对于蛋白鉴定的图象分析、微量测序；进一步对肽片段进行鉴定的氨基酸组分分析和与质谱相关的技术.(1)图象分析技术(Imageanalysis).“满天星”式的2-DE图谱分析不能依靠本能的直觉，每一个图象上斑点的上调、下调及出现、消失，都可能在生理和病理状态下产生，必须依靠计算机为基础的数据处理，进行定量分析.在一系列高质量的2-DE凝胶产生(低背景染色，高度的重复性)的前提下，图象分析包括斑点检测、背景消减、斑点配比和数据库构建.首先，采集图象通常所用的系统是电荷耦合CCD(chargecoupleddevice)照相机；激光密度仪(laserdensitometers)和Phospho或，对图象进行数字化.并成为以象素(pixels)为基础的空间和网格.其次，在图象灰度水平上过滤和变形，进行图象加工，以进行斑点检测.利用Laplacian，Gaussian，DOG(differenceofGaussians)opreator使有意义的区域与背景分离，精确限定斑点的强度、面积、周长和方向.图象分析检测的斑点