生物技术与食品安全

现代生物技术与食品安全一、概述进入20世纪中叶，随着人类生产力的发展，人类对环境的索取越来越多，而还给环境却是污染。由此而引发了许多疾病和食品的污染，故食品安全也越来越成为世界关注的焦点。生物技术是一把双刃剑，对人类有利也有弊益处：改造农作物，使其产生对病虫害的抵抗力；利用生物技术生产农药利用生物技术改造家畜和家禽利用生物技术使其内源性生长激素增加利用生物技术检测食品的安全性对人类不利：如果对生物技术不加以管理，就会对人类产生灾难性的后果，这些后果有短期的，也有长期的生物技术对人类的潜在危害在其发展的初期就被科学家们认识到了，在发展现代生物技术食品的同时，相应的管理和安全性评价也在世界各国展开二、生物技术食品安全性评价的基本内容生物技术食品的安全性是现代生物技术食品发展过程中首先面临的问题之一利用基因工程技术生产的食品，作为一种新型的食品种类安全性问题一直是科学界、政府、消费者关注的热点。1、生物技术食品安全性评价问题的由来1953年Watson和Crick遗传物质DNA双螺旋结构20世纪60年代末斯坦福大学教授BergDNA与猴病毒SV40的DNA连接重组DNA1973年的Gordon会议1975年Asilomar会议专门针对专基因生物的安全进行了讨论美国国立卫生院依据专家会议的讨论结果制定了美国的生物技术管理条例20世纪80年代后期，第一例基因重组生物技术食品牛乳凝乳酶商品化生产1993年OECD出版了《由现代生物技术生产的食品的安全性评价——概念与原则》1994年世界卫生组织在召开了名为“实质等同性在评估由现代生物技术培育的植物食品或者食品成分的安全性方面的应用”讨论会1996年OECD又出版了一部关于《食品安全性评估》的专题讨论论文1996年世界卫生组织和联合国粮农组织于在罗马共同召开了名为“生物技术和食品安全”的研讨会。1996和2000年的FAO/WHO专家咨询会议以及2000年和2001年在日本召开的世界食品法典委员会（CAC）转基因食品政府特别会议对“实质等同原则”给予肯定。2、转基因食品安全性评价的目的与原则安全性评价的目的①提供科学决策的依据②保障人类健康和环境安全③回答公众疑问④促进国际贸易，维护国家权益⑤促进生物技术的可持续发展安全性评价的原则①遗传工程体特性分析②实质等同性原则安全性评价的原则（1）遗传工程体特性分析①供体来源、分类、学名，与其他物种的关系；作为食品食用的历史，有无有毒史、过敏性、传染性、抗营养因子、生理活性物质，该供体的关键营养成分等②被修饰基因及插入的外源DNA介导物的名称、来源、特性和安全性。基因构成与外源DNA的描述，包括来源、结构、功能、用途、转移方法、助催化剂的活性等③受体与供体相比的表型特性和稳定性，外源基因的拷贝量，引入基因移动的可能性，引入基因的功能与特性。（2）实质等同性将转基因植物、动物、微生物产生的食品分为三类①转基因食品与现有的传统食品具有实质等同性②除某些特定的差异外，与传统食品具有实质等同性③与传统食品没有实质等同性什么叫实质等同性实质性等同性原则当某个有转基因技术生产的新食品的各项主要特征（分子学特征、遗传形状、主要营养成分等）与现有食品大体相同，则认为该新食品的安全性也与现有食品大体等同实质等同性的主要内容（1）生物学特性的比较对植物来说包括形态、生长、产量、抗病性及其他有关的农艺性状对微生物来说包括分类学特性（如培养方法、生物型、生理特性等）、定殖潜力或侵染性、寄主范围、有无质粒、抗生素抗性、毒性等动物方面是形态、生长生理特性、繁殖、健康特性及产量等（2）营养成分比较包括主要营养因子、抗营养因子、毒素、过敏原等。主要营养因子包括脂肪、蛋白质、碳水化合物、矿物质、维生素等；抗营养因子主要指一些能影响人对食品中营养物质的吸收和对食物消化的物质，如豆科作物中的一些蛋白酶抑制剂、脂肪氧化酶以及植酸等。毒素指一些对人有毒害作用的物质，在植物中有马铃薯的茄碱、番茄中的番茄碱等。过敏原指能造成某些人群食用后产生过敏反应的一类物质，如巴西坚果中的2S清蛋白在进行评价是应根据下列情况分别对待①与现有食品及食品成分具有完全实质等同性②与现有食品及成分具有实质等同性，但存在某些差异③与现有食品无实质等同性转基因食品安全性评价原则——实质等同性原则将转基因食品分成三类：比较结果评价内容1.实质性等同不必做评价，新食品是安全的—————————————————————————————2.除引入的新性状外，仅评价转基因产物及其具有实质性等同催化产生的其它物质—————————————————————————————3.不具实质等同性全面分析新食品的营养性和安全性—————————————————————————————鉴于此，对转基因食品安全性应采取个案分析的方法，而不能一概而论。3、转基因食品安全性评价的几个主要问题过敏原毒性物质抗生素抗性标记基因食物过敏是人类食物使用史上一个由来已久的卫生问题食物过敏常发生在某些特殊人群，全球有近2％成年人和4％～6％的儿童有食物过敏史食物过敏是指在食品中含有某些能引起人产生不适反应的抗原分子，这些抗原分子主要是一些蛋白质，这些蛋白质具有对T-细胞和B-细胞的识别区，可以诱导人免疫系统产生免疫球蛋白E抗体（IgE).转基因食品安全性的确定按以下步骤进行第一步，是作目标蛋白的免疫反应分析如果基因来自一种常见过敏原种血清,14种血清的分析如果基因来自一种不常见的过敏原种血清,5种血清第二步，如果转基因食品中含常见的过敏原基因，体外免疫试验分析为阴性或结果模棱两可，则转基因食品必须作进一步的皮肤穿刺试验，皮肤阳性即足以证明转基因食品的提取物能促发皮肤嗜碱白细胞释放组胺。第三步，也就是最后对过敏病人作双盲、以安慰剂做对照的食物实验,以确定转基因食品的安全性基因来源（过敏性）固相免疫分析常见过敏原和不常见过敏原（8类，106种食品）是序列相似性1否阳性消化/加工稳定性皮肤传次试验DBPCFC(IRB)标签表明来源市场请示监控机构阴性3阴性4阳性阳性阳性阳性阴性阴性2阳性注:1与所有已知的过敏原比较氨基酸序列相似性,分析所有基因产物对消化的稳定性2固相免疫分析取决于能用多少血清.理想的血清是14种.如果少于5种,分析结果为阴性,则进行消化/加工稳定性测试,结果为阳性时应请示相应的监控机构3如果结果模棱两可或怀疑为阴性,则进入皮试4根据固相免疫分析和皮试结果,如果没有证据证明有过敏性,则进行食品的DBPCFC试验.DBPCFC表示双盲,以安慰剂作对照的食物试验,为保证没有过敏性,DBPCFC实验必须经IRB批准来源于生物技术食品潜在过敏原的评价程序FAO/WHO2001外源基因是否来源于已知过敏原生物比较氨基酸序列同源性比较氨基酸序列同源性特异性血清筛选实验定向血清筛选实验可能是过敏源胃蛋白酶笑话实验和动物模型实验+/+高可能的过敏源+/--/-低非过敏源是否是是否是否否否毒性物质是指那些有动物、植物和微生物产生的对其他中生物有毒的化学物质从化学的角度看毒性物质包括了几乎所有类型的化合物从毒理学方面看毒性物质可以对各种器官和生物靶位产发生化学和物理化学的直接作用，因而引起机体损伤、功能障碍以及致畸、致癌、甚至造成死亡等各种不良胜利效应抗生素抗性标记基因抗生素抗性基因所编码的酶在消化时对人体产生的直接效应抗生素抗性基因水平转入肠道上皮细胞肠道微生物的潜在可能性抗生素抗性基因水平转入环境微生物的潜在可能性未预料的基因多效性三、食品安全的生物技术检测方法现代分子检测技术（1）免疫学检测技术（2）核酸检测技术（3）转基因食品的检测技术（4）生物芯片与生物传感器的检测技术1、免疫学检测技术免疫学基础知识抗原和抗体（免疫球蛋白）之间的结合特异性是免疫学检测技术的基础在检测中，抗原应该是要检测的对象，而抗体是抗原刺激产生的具有对抗原特异结合能力的免疫球蛋白从目前的现代分子检测技术而言，免疫学检测方法是最特异、做灵敏、用途最广泛的技术之一免疫检测技术的主要方法（1）凝集反应指颗粒抗原与相应抗体结合反应出现的可以通过肉眼或显微镜观察的现象（2）沉淀反应当抗原为可溶性分子时，在与抗体结合后就形成沉淀。其包括：a絮状沉淀反应b环状沉淀反应c双向扩散d单项免疫扩散e微量免疫电泳f对流免疫电泳g火箭电泳双向扩散单向扩散（3）酶联免疫吸附测定法(ELISA)是酶免疫技术的一种。其优点如下:a专一性强b灵敏度高c样品易于保存d结果易于观察e可以定量测定f仪器和试剂简单，操作比较简单，操作人员不需采取安全防护措施。ELISA的几种主要方法①用间接ELSIA法检测特异性抗体②直接ELISA检测方法③双抗夹心ELISA检测方法测定抗原④双抗夹心ELISA检测方法测定特异性抗体⑤竞争ELISA法测定抗原⑥酶的交联技术辣根过氧化物酶二氨基联苯胺深褐色沉淀5-氨基水杨酸棕色449邻苯二胺橘红色492、460邻连甲苯胺蓝色4254-硝基酚磷酸黄色400碱性磷酸酶萘酚-As-Mx磷酸盐红色500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖黄色405、420表8-1免疫酶技术常用的酶-底物系统酶底物显色反应测定波长(nm）（4）单克隆抗体单克隆抗体是指在一株B淋巴细胞中的每一个细胞只能产生一种它所专有的、针对一种它能识别的抗原决定簇的抗体，从这样的一株B细胞系产生的抗体即为单克隆抗体。操作步骤1、抗原制备2、免疫动物3、免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备4、细胞融合5、杂交瘤细胞的选择培养6、杂交瘤细胞的筛选7、杂交瘤细胞的克隆化8、单克隆抗体的检定9、分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立10、单克隆抗体的大量制备单克隆抗体制备示意图2、核酸分子检测技术聚合酶链式反应（PCR)Southern杂交Northern杂交连接链式反应（LCR)PCR-ELISA检测PCR反应原理PCR反应原理没有产物①反应不平衡检查反应各组分浓度②反应循环条件检查反应循环条件③多加或漏加某种成分用同样模板和试剂重复反应④模板浓度太低增加模板的浓度⑤引物浓度或顺序不优化优化引物的浓度或重新设计引物⑥模板质量太差①使用可以扩增小片段的引物（降解、污染、含抑制因子）②尝试加入DMSO和去污剂增加反应效率③控制Mg浓度1.5～5.0mmol④选择合适的DNA提取方法重新提取高质量的DNA模板⑤将常用模板贮存在4℃冰箱⑦Tap酶量不够或活力低①用阳性对照和引物扩增②用新批次的酶③增加循环次数表8-2普通PCR易出现的问题、可能原因和解决方法问题可能原因解决方法④增加酶的浓度⑧反应条件不优化优化反应条件产物呈弥撒状次级扩增产物检查各组分浓度和循环条件检查Mg浓度优化引物浓度减少循环次数减少模板数量减少聚合酶的数量非特异扩增产物引物的非特异性结合提高退火温度优化引物浓度用热启动PCR反应重新设计特异性引物减少Mg浓度模板被污染使用新模板问题可能原因解决方法3、转基因食品的检测技术转基因生物的特性转基因生物中被整合到宿主基因中的外源基因一般都具有共同的特点，即由启动子，结果基因和终止子组成，一般称之为基因盒在检测转基因食品时，主要针对外源启动子、终止子、筛选标记基因、报告基因和结果基因的DNA序列和产物进行检测PCR检测技术①普通PCR检测技术②巢式PCR技术③多重PCR技术④PCR-ELISA技术⑤定量PCR技术等基于蛋白质基础的检测技术①酶学检测技术②免疫学检测技术4、生物芯片与生物传感器检测技术生物传感器的基本概念及应用生物传感器是由固定化的并有化学分子识别功能的生物材料、换能器及信号放大装置的分析工具或系统。其应用有：①检测食品的新鲜度②食品中细菌和病原菌的检测③食品中毒素的检测④食品中添加剂的检测生物芯片的基本概念与应用通过微加工技术制作的生物芯片，可以把成千上万乃至几十万个生命信息集成在一个很小的芯片上，达到对基因、抗原和活体细胞等进行分析和检测的目的