植物的组织培养(浙科版选修1)

植物的组织培养1.进行菊花的组织培养2.尝试植物激素的应用通过必修课的学习，我们已经了解到大多绿色开花植物都是靠种子来繁殖的。那么，有没有不用种子来培育植物的方法呢？组织培养营养繁殖扦插嫁接压条扦插嫁接压条一、基础知识课题1：菊花的组织培养1、植物的组织培养（1）细胞的分化①概念：在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差异的过程②过程：如：受精卵增殖、生长、分化形成组织、器官、系统③特点：B.稳定性：细胞分化是稳定的，一般是不可逆转的C.全能性：已分化的细胞，仍具有发育的潜能A.持久性：是一种持久性的变化，它发生在生物体的整个生命过程中,在胚胎期达到最大限度⑤原因：基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果④结果：形成不同的细胞和组织（2）细胞的全能性①定义：生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个体的潜能的特性②原理：生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因高度特化的动物细胞，从整个细胞来说，全能性受到限制。但它的细胞核仍然保持着全能性，这是因为细胞核内含有该物种遗传性所需要的遗传物质已分化的植物细胞，仍具有全能性③实例受精卵生殖细胞体细胞④全能性的比较:在生物的所有细胞中，受精卵的全能性是最高的，进行有性生殖的生物体的任何一个细胞，都是由受精卵分裂、分化而成。生殖细胞，尤其是卵细胞，虽然分化程度很高，但是仍然又较高的潜在全能性，在某些条件下卵细胞可以进行孤雌生殖（3）植物组织培养细胞离体①必要条件：一定的营养物质、激素和其他外界条件②原理:细胞的全能性外植体：从活植物体上切下进行培养的那部分细胞、组织或器官③相关概念:脱分化：指已经分化的植物器官、组织或细胞,当受到创伤或进行离体(也受到创伤)培养时,已停止分裂的细胞,又重新恢复分裂,细胞改变原有的分化状态,失去原有结构和功能,成为具有未分化特性的细胞。再分化：已经脱分化的细胞在一定条件下,又可经过愈伤组织或胚状体,再分化出根和芽,形成完整植株,这一过程叫作再分化。愈伤组织:细胞排列疏松而无规则,是高度液泡化的、成无定性状态的薄壁细胞流程图④过程:离体组织或细胞植物体脱分化细胞分裂素≈生长素愈伤组织芽根细胞分裂素生长素细胞分裂素生长素再分化植物细胞培养不需要光需要光⑤愈伤组织形态发生方式不定芽方式：由愈伤组织细胞诱导分化出具有胚芽、胚根、胚轴的胚状结构进而长成完整的植株，这种由愈伤组织中的薄壁细胞不经过生殖过程，直接产生类似于胚的结构，叫做胚状体在某些条件下，愈伤组织中的分生细胞发生分化，形成不同的器官原基，再逐渐形成芽和根胚状体方式：2、影响植物组织培养的因素（1）植物材料的选择烟草和胡萝卜的组织培养较为容易枸杞愈伤组织的芽诱导比较难同一植物材料的年龄、保存时间的长短会影响实验结果菊花的组织培养一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝二、菊花的组织培养(一)设备及用品1.100ml三角瓶或大口培养瓶2.镊子3.超净台4.灭菌锅5.封口膜和橡皮圈6.有棉球的广口瓶7.酒精灯8.三角漏斗9.培养皿(二)材料1.MS培养基(用于配置发芽和生根培养基)2.奈乙酸用少量0.1mol/LNaOH溶液溶解,苄基腺嘌呤用少量0.1mol/LHCL溶解3.发芽培养基(灭菌)4.生根培养基(灭菌)（2）不同的离体组织和细胞对营养、环境等条件的要求相对特殊，需配置不同的培养基MS培养基主要成分包括：A、大量元素:N、P、K、Ca、Mg、S等①氮:常用的是硝态氮（如硝酸钾）和铵态氮（如硫酸铵），MS培养基即含硝态氮又含铵态氮植物组织从培养基中吸收NO3-或NH4+后，经过一系列的反应转化成氨基酸，进而合成蛋白质，成为植物体的主要组成部分②磷：常由磷酸盐提供，是植物必需元素之一。磷参与植物生命过程中的核酸合成、蛋白质合成、光合作用、细胞呼吸以及能量的储存、转化与释放等重要生化过程，因此，植物组织培养中需要大量的磷③钾：影响植物组织培养中酶的活性和方向，决定新陈代谢的方向，对分化有一定的促进作用B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等①铁：用量较多的微量元素，对植物组织叶绿素的合成和延长生长起重要作用②铜：促进离体根生长作用③钼：合成活跃的硝酸还原酶，固氮酶的组成部分，防止叶绿素被破坏④硼：与糖的运输、蛋白质的合成有关C、有机物:如氨基酸、烟酸、肌醇、维生素，蔗糖等你能说出各种营养物质的作用吗？同微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。①常用的植物激素：生长素、细胞分裂素和赤霉素生长素类：2，4－二氯苯氧乙酸（2，4－D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）细胞分裂素类：激动素（KT）、6－苄基嘌呤（6－BA）、玉米素（ZT）赤霉素类：赤霉酸（GA3）（3）植物激素的影响②生长素和细胞分裂素作用植物中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。在生长素存在的情况下，细胞分裂素的作用呈现加强的趋势使用顺序实验结果先使用生长素，后使用细胞分裂素有利于细胞分裂，但不利分化先使用细胞分裂素后使用生长素细胞即分裂也分化同时使用分化频率高生长素细胞分裂素：有利于根的分化生长素细胞分裂素：有利于芽的分化，抑制根的分化生长素细胞分裂素：＝促进愈伤组织生长③生长素和细胞分裂素同时使用，用量的比例对植物细胞发育方向的影响（4）pH、温度、光照pH控制在5.8左右，温度控制在18－22。C,每日用日光灯照射12h讨论：你能说出各种营养物质的作用吗？同专题2中微生物培养基的配方相比，MS培养基的配方有哪些明显的不同？答：微量元素和大量元素提供植物细胞生活所必需的无机盐；蔗糖提供碳源，同时能够维持细胞的渗透压；甘氨酸、维生素等物质主要是为了满足离体植物细胞在正常代谢途径受到一定影响后所产生的特殊营养需求。微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。二、实验操作（一）制备MS固体培养基MS培养基包括20多种营养成分，实验室一般使用4。C保存配制好的培养基母液来制备1、配置各种母液为了避免每次配制培养基都要称量几十种成分，减少工作量，可以将各种成分按比例配置成浓缩液，即培养基母液，一般将常用药品配成比所需浓度高10－100倍的母液。使用时，根据浓缩比例计算用量，加水稀释①无机物中大量元素浓缩10倍，微量元素浓缩100倍，常温保存②激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按1mg/ml的质量浓度单独配制成母液③用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量2、配置培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml或100ml①配制培养液配制1LMS培养基，先将称好的琼脂加800ml蒸馏水，加热使琼脂溶化，然后加入蔗糖30g，取配制好的大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容至1000ml②调PH③培养基的分装由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素3、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌1、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝（二）外植体消毒2、消毒①流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min左右②酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为70％的酒精中摇动2－3次，持续6－7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗③消毒液处理取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为0.1％的氯化汞溶液中1－2min，取出后在无菌水中至少清洗3次，漂净消毒液（三）接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用70％的酒精喷雾使空气消毒，酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射20分钟1、接种室消毒2、无菌操作要求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。3、材料的切取和接种将装有培养基的锥形瓶整齐地排列在酒精灯左侧。将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段（长约0.5-1cm）。左手持锥形瓶。右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥在右手手心，以避免封口膜接触瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋转通过火焰，右手用镊子夹取菊花茎段，放入培养基中。插入时应注意不要倒插。每瓶接种6－8块外植体。接种后，将封口膜重新扎好（二）外植体（离体组织）消毒注意：对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。1、70﹪酒精中浸泡10min，无菌水冲洗2、5%次氯酸钠溶液中浸泡，无菌水冲洗3、用另一5%次氯酸钠溶液浸泡5min，无菌水冲洗4、超净台中用无菌水多次冲洗（三）切段后接种1、先用肥皂洗手，穿上工作服，戴上口罩和工作帽。2、放入培养瓶和灭菌后的接种用具(镊子、解剖刀、接种针)，把镊子、解剖刀、接种针插入内盛70%酒精的广口瓶中。3、在酒精灯火焰旁，打开三角瓶，把花茎用无菌解剖刀切成几段，每段至少有一张叶片4、切段插入培养基，诱导愈伤组织，盖上封口膜。5、愈伤组织插入生芽培养基，盖上封口膜。6、用记号笔在瓶壁上写明培养材料、培养基代号、接种日期。注意事项全部接种操作都是在无菌条件下进行的，所以要特别认真仔细，以防杂菌污染。（四）培养接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养。培养期间应定期消毒，温度控制在１８～２5℃，并且每日照光１4.5小时。观察记录生长情况，并照相存档。2-3周后将生长健壮的丛状苗在无菌条件下一个个转入生根培养基中，在上述条件下继续培养(三)步骤1.取外植体超净台上将无菌幼苗切段,每段至少1张叶片2.生芽培养生芽培养基中,放入1-3段切段(茎部插入培养基,盖上封口膜.日光灯下保持18~25℃的温度培养,每天光照不少于14.5h3.生根培养2~3周后,将丛状苗在无菌条件下转入生根培养基中,在上述条件下继续培养.4.适应锻炼将苗转移至草炭土或蛭石中,用玻璃罩或塑料布保持80％以上的湿度,2~3天后打开减低湿度进行锻炼,直到将罩全部打开处于自然湿度下为止4、接种注意事项①每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为75％的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种②外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜3－4块，菊的茎或叶6－8块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件③插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分思考：你打算做几组重复？你打算设置对照实验吗？答：每种材料或配方至少要做一组以上的重复。设置对照实验可以取用一个经过灭菌的装有培养基的锥形瓶，与接种操作后的锥形瓶一同培养，用以说明培养基制作合格，没有被杂菌污染。（四）培养1、愈伤组织的培养从接种外植体到出现愈伤组织需经过2周时间。2周之内可以看到外植体上逐渐长出乳白色或黄白色的瘤状愈伤组织。首次培养愈伤组织时，恒温箱的门应该关闭不必见光，因为在无光条件下愈伤组织长的更快。2周后，培养基成分接近耗尽，必须更换培养基，进行继代培养继代培养所用的培养基与培养愈伤组织的相同，在严格的无菌条件下，将愈伤组织连同原来的外植体一起移到新培养基上。愈伤组织的继代培养一代为20d。如果延长时间，培养基中营养物质减少，外植体会分泌有毒物质，造成自身中毒。如果愈伤组织长到直径为1－1.5cm时，就可以进行试管苗培养，否则还需进行第二代继代培养2、愈伤组织的继代培养在愈伤组织继代培养期间，将恒温箱的门打开，让愈伤组织见光，愈伤组织见光后颜色可以转为绿色3、试管苗的培养当愈伤组织长到一定大小