细胞生物学实验指导讲义

实验一细胞的基本形态结构的观察实验原理与目的（1）通过观察动、植物细胞，了解细胞形态的多样性并掌握光镜下细胞的基本形态结构。（2）初步掌握临时制片技术和显微绘图的方法。实验原理细胞是生命活动的基本结构单位和功能单位。构成人体或其他高等动物或植物的细胞种类繁多，形态各异。细胞的形态都与它们的功能相适应。如具有运输O2和CO2功能的红细胞为双凹盘状；具有感受刺激与传导功能的神经细胞呈星芒形，附有长短不等的树枝状突起；上皮细胞是柱形或扁平形；巨噬细胞则呈不规则形状，并能伸出伪足，以利于为执行吞噬和消灭外源的病原微生物的功能。虽然细胞在形态上多种多样、大小不同，但却具有共同的基本结构特点，即都是由细胞膜（cellmembrane）、细胞质(cytoplasm)和细胞核(nucleus)组成。实验用品1．器具：显微镜、载玻片、盖玻片、推片、吸管、镊子、牙签、擦镜纸、吸水纸、小剪刀。2．材料：洋葱、人口腔上皮细胞、鸡血液、人血细胞涂片、蟾蜍血细胞涂片。3．试剂：2%碘液、Giemsa染液。试剂配制1．2%碘液：称取碘片2g，碘化钾5g，蒸馏水100ml混匀溶解即可。2．吉姆萨(Giemsa)染液：吉姆萨粉(Giemsastain)l.0g甘油(AR)66ml甲醇(AR)66ml将Giemsa粉放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再将全部甘油倒入，放56℃温箱中2h后，加入甲醇，将配制好的染液密封保存棕色瓶内(最好于0~4℃保存)。内容与方法一、洋葱鳞茎表皮细胞制片与观察：1.临时制片：取一擦净的载玻片，在玻片中央滴一滴2%的碘液，将洋葱茎用小刀分为几块，取一块肉质鳞叶，用镊子在其表面轻轻撕下一小块膜质表皮，再用剪刀剪成3～4mm2的小块，置于载玻片的染液中铺平，染色2～3分钟，盖上盖玻片，用吸水纸吸去盖玻片周围多余的染液。2.观察：将标本置于低倍镜下观察，可见许多长柱状排列整齐、彼此相连的细胞，选择其中较典型的细胞移至视野中央，然后换成高倍镜观察以下结构：1）细胞壁：在每两个细胞相连处，可看到二层壁状结构，是相邻细胞各自的细胞壁，有纤维素构成。细胞膜紧贴在细胞壁内侧，不易看到。2）细胞核：呈椭圆形，位于中央，被染成黄色，成熟的细胞由于液泡的挤压，核位于质膜边缘。细胞核一般有1～2个折光较强并染成黄色的核仁。（3）细胞质：是细胞膜以内，细胞核以外的物质，染色较浅，有1至数个液泡及微细颗粒（图1-1）。二、人口腔粘膜上皮细胞制片与观察：1.临时制片：在一张擦净的载玻片中央滴一滴2%的碘液，取一根牙签，用其粗端在自己口腔中的脸颊上刮几下，将其刮下的粘膜上皮细胞涂布在碘液中，染色2～3分钟，盖上盖玻片，用吸水纸吸去盖玻片周围多余的染液。色2～3分钟，盖上盖玻片，用吸水纸吸去盖玻片周围多余的染液。2.观察：将制好的玻片标本置于低倍镜下观察，可见细胞被染成黄色，成群或分散存在。由于该细胞体积较小，着色较淡，观察时应稍降低视野中的亮度，选择较分散且轮廓清楚的细胞移至视野中央，换成高倍镜观察以下结构。1）细胞膜：是包围在细胞最外层的膜状结构，细胞呈扁平不规则的类圆形，细胞膜有些地方出现皱褶。2）细胞核：圆形或椭圆形的细胞核呈深黄色位于细胞中央，核中有时可见一致密的结构，即为核仁。3）细胞质：是细胞膜与细胞核之间染色较浅的物质（图1–2；图1-3）。2.观察：将已经染好的血涂片标本（肉眼可见血膜呈粉红色）放置在低倍镜下，检查整个血涂片，选择细胞均匀分布、较少重叠的区域，然后转换高倍镜下仔细观察，在人的血涂片上红细胞数目多、体积小、呈圆饼状，无细胞核（图1-4），胞质呈粉红色；白细胞比例较小，寻找较困难，但胞体较大，细胞核明显，形态多样，呈兰紫色。鸡的血细胞、蛙的血细胞的形态与人类有很大不同，在鸡或蛙血的红细胞涂片中，可见红细胞呈卵圆形，并且有椭圆形的细胞核（图1-5）。图1-4人血红细胞的形态??图1-5鸡血红细胞的形态作业与思考题1.绘制高倍镜下洋葱鳞茎表皮细胞、人口腔黏膜上皮细胞图，并注明各部分结构的名称。2.生物绘图的基本要求是什么？实验二细胞大小的测量实验目的学习显微测量方法实验原理应用显微镜的成像原理，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，得出细胞的大小。(目镜测微尺测量倍率比照表)实验材料、用品材料：人口腔上皮细胞,鸡血红细胞、洋葱鳞叶表皮细胞。仪器(请参看仪器图库)：测微尺、显微镜。物镜测微尺目镜测微尺实验步骤(一)测微尺的使用操作1.卸下目镜的上透镜，将目镜测微尺有刻度一面向下装在目镜镜面上，再旋上目镜的上透镜。2.将镜台测微尺有刻度一面朝上放在载物台上夹好，使测微尺刻度位于视野中央。调焦至看清镜台测微尺的刻度。3.小心移动镜台测微尺和目镜测微尺(如目镜测微尺刻度模糊，可转动目镜上透镜进行调焦)，使两尺左边的0点一直线重合，然后由左向右找出两尺另一次重复的直线(图1-6)。4?记录两条重合线间目镜测微尺和镜台测微尺的格数。按下式计算目镜测微尺每格的长度等于多少μm目镜测微尺每格的长度/μm=镜台测微尺的格数/目镜测微尺的格数(二)花粉细胞的观察测量1．采集刚开放或将要开放的成熟花朵；2.在载玻片滴1~2滴蒸馏水；3.用接种针将花粉分散于蒸馏水上，盖上盖玻片；4.用测微尺测量花粉细胞大小，计算平均值。附：鸡血细胞的观察测量将已经制备好的鸡血涂片放在染色盘架上，滴数滴瑞氏-吉姆萨染液欲涂片上，静置染色1分钟，滴加等量1/15mol/L磷酸缓冲液，用牙签轻轻搅拌混匀，再静置染色5－10分钟，最后用清水缓缓冲洗1分钟，倾斜放置，凉干后进行观察测量。实验报告用测微尺测量不同材料各种细胞的大小后，制表格表示测量结果。注意事项载物台上物镜测微尺刻度是用加拿大树胶和圆形盖玻片封合的。当除去松柏油时，不宜使用过多的二甲苯，以避免盖玻片下的树胶溶解。取出目镜测微尺，将目镜放回镜筒，用擦镜纸擦去目镜测微尺上的油腻和手印思考题分别计算不同物镜放大倍数下测微尺的单位。实验三植物细胞骨架的观察一、实验目的1.掌握考马斯亮蓝R250对植物细胞骨架染色的方法。2.通过对洋葱内皮细胞的处理，掌握植物细胞骨架的制备方法与显微形态观察。二、实验原理细胞骨架(cytoskeleton)，是细胞内以蛋白质纤维为主要成分的网络结构，根据蛋白质纤维的直径、组成成分和组装结构的不同可分为微丝、微管和中等纤维。细胞骨架对于维持细胞的形态结构及细胞运动、物质运输、能量转换、信号传导和细胞分裂等有重要的作用。本试验采用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理植物材料时，可将细胞的膜结构和大部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白却被保存下来，后者用考马斯亮蓝R250染色，在光学显微镜下可见一种网状结构。三、实验用品(一)材料洋葱（二）器材显微镜、载玻片、滴管、擦镜纸、PH计（三）试剂1.0.01mol/L磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)0.2mol/LNa2HPO4-NaH2PO4缓冲液（PB，PH7.3）50ml0.15mol/LNaCl双蒸馏水加至1000ml2.PB0.2mol/LNa2HPO477ml0.2mol/LNaH2PO423ml3.M-缓冲液咪唑(PH6.7)50mmol/LKCl50mmol/LMgC120.5mmol/LEGTA1mmol/LEDTA0.1mmol/L巯基乙醇1mmol/L甘油4mmol/L用1mol/LHCl调pH至7.2。4.1%的TritonX-100/M-缓冲液5.0.2%考马斯亮蓝R250染液甲醇46.5ml冰醋酸7ml蒸馏水46.5ml6.3%戊二醛-PB溶液（PH7.3）四、实验操作见图4-4取洋葱内皮1cm左右置于含PBS液的载玻片上湿润后，吸去PBS加2滴1%TritonX-100/M-缓冲液，5min吸去缓冲液，加3%戊二醛-PB溶液，固定30min加PBS洗2次，共3min加0.2%考马斯亮蓝R250染色30min用PBS洗2次，共2min，吸干镜检并绘图图4-4细胞骨架标本制作过程五、实验建议1.用去垢剂TritonX-100的缓冲液处理材料时，应控制在30min左右。2.每一次加液或染色后，应用PBS洗2次，并用滤纸吸干。六、实验报告及作业1.画出实验所观察到的细胞骨架图，并注明放大倍数。2.为什么用TritonX-100的缓冲液处理材料？实验四细胞中多糖和过氧化物酶的定位【实验目的】掌握显示细胞中多糖和过氧化物酶反应的原理和方法。【实验原理】高碘酸—雪夫试剂反应，简称PAS反应。主要是利用高碘酸作为强氧化剂，这种强氧化剂能打开C-C键，使多糖分子中的乙二醇变成乙二醛，氧化所得到的醛基与Schiff试剂反应形成紫红色化合物。颜色的深浅与糖类的多少有关。细胞内的过氧化物酶能把联苯胺氧化为蓝色或棕色络合物，根据蓝色或棕色的出现来表示过氧化物酶的存在。PAS反应过程如下：过氧化物酶联苯胺反应过程如下：【实验仪器、材料和试剂】（一）仪器显微镜、镊子、染色钵、刀片、载玻片、盖玻片、吸水纸等（二）材料马铃薯块茎、洋葱根尖或洋葱鳞茎（三）试剂1．高碘酸溶液：高碘酸（HIO4·2H2O）0.4g，95%乙醇35ml，M/5醋酸钠溶液（2.72g醋酸钠溶于100mlH2O）5ml，蒸馏水10ml2．Schiff试剂（配法见Feulgen反应）3．亚硫酸水溶液（配法见Feulgen反应）4．70%乙醇5．联苯胺溶液：在0.85%盐水内加入联苯胺至饱和为止，临用前加入20%体积的H2O2，每2ml加一滴。6．0.1%钼酸铵溶液：称取0.1g钼酸铵溶于100ml0.85%盐水.【方法与步骤】.（一）细胞中多糖的测定：高碘酸—雪夫（PAS）反应1．把马铃薯块茎用刀片徒手切成薄片。2．浸于高碘酸溶液5～15min。3．移入70%乙醇中浸片刻。4．Schiff试剂染色15min。5．亚硫酸溶液洗三次，每次1min。6．蒸馏水洗片刻。7．装片镜检。镜检结果：细胞中多糖部位呈现紫红色。（二）细胞中过氧化物酶的测定：联苯胺反应1．把洋葱根尖徒手切成20～40μm厚的薄片或用镊子撕取洋葱鳞茎内表皮一小块。2．浸在溶有0.1%钼酸铵的0.85%盐水溶液中5min（钼酸铵的作用是催化剂）。3．浸在联苯胺溶液内2min至切片出现蓝色。结果：细胞中有蓝色沉淀出现【作业】1．简述PAS反应及联苯胺反应的原理。2．绘图示细胞中多糖及过氧化物酶的分布。实验五细胞核与线粒体的分级分离【实验原理与目的】（1）了解细胞器分级分离的原理。。（2）初步掌握细胞核与线粒体的分级分离。（3）熟悉离心机、匀浆器的使用方法。【实验原理】细胞组分的分级分离是研究亚细胞组分的化学组成、理化特性及其功能的基本方法。细胞内各种结构的大小、形状和密度不同，在同一离心场内的沉降速度也不同，因此在密度均一的介质中，在不同大小的离心力场的作用下，组分先后沉降而初步分离。差速离心只能将那些大小有显著差异的成分分离开，更精细的分离则要采用密度梯度离心。细胞组分的分离是通过组织匀浆、分级离心等步骤完成的(图)。图11.差速离心技术各步骤图解【实验用品】1．玻璃匀浆器、台式高速冷冻离心机、普通离心机、EP管、微量进样器、tip头、剪刀、镊子、小烧杯、离心管、载玻片、盖玻片、滴管、普通光学显微镜、滤纸、8层纱布或尼龙网(200目)、冰块。2．材料：小白鼠肝脏。3．试剂：匀浆介质(O．25mol／L蔗糖水溶液，含0．003mol／LCaCl2)、甲基绿一派洛宁染液、?95％乙醇、丙酮、生理盐水、中性红一詹纳斯绿B染液。【试剂配制】1）甲基绿-派洛宁染液：①0.2mol／L醋酸缓冲液(pH4．8)：冰醋酸1．2ml，加蒸馏水至100ml；醋酸钠2.72g溶于100ml蒸馏水中。使用时两液按2：3比例混合；A液：5％派洛宁水溶液4ml、2％甲基绿水溶液14ml、蒸馏水16ml；B液：0.2mol／I。醋酸缓冲液(pH4.8)16ml。使用时临时将A液与B液混合(5∶2)。。2）中性红-詹纳斯绿B染液：①将3滴詹纳斯绿B饱和水溶液(溶解度5.18％)加到5ml无水乙醇中，然后