动物细胞工程

2020/2/24邓宁副教授暨南大学生命科学技术学院抗体工程研究中心动物细胞工程2005邓宁第一章序论第二章动物细胞培养第三章细胞融合第四章淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体一、细胞篇2005邓宁第一讲概论掌握内容：概念：生物工程，细胞工程，细胞拆合，干细胞，转基因动物动物细胞工程包含哪些研究内容2005邓宁生物工程—生物技术（生物工艺学）：是以生命科学为基础，利用生物体系和工程学原理生产生物制品和创造新物种的一门综合技术。也就是利用生物有机体或其组成部分发展新工艺或制造新产品的一种科学技术。2005邓宁生物工程被誉为古今新技术革命的前沿技术之一，许多国家都把生物工程列为优先发展的技术，人们预计，下个世纪是生物工程的年代。2005邓宁生物工程的发展历史•第一代生物工程•1857年巴斯德证实酒精发酵是由活酵母引起•19世纪末到20世纪30年代，不少工业发酵的出现，以工业微生物工程生产发酵产品为代表的真正意义的生物工程正式诞生。2005邓宁近代生物工程1928年弗来明发明青霉素，1943年开发出青霉素的生产工艺现代生物工程20世纪70年代，随着基因重组、细胞和组织培养、酶的固定化、动植物细胞的大规模培养、现代生物反应器和计算机等技术的应用，生物工程进入到新的发展阶段DNA重组、细胞融合等技术克隆羊“多莉”的诞生2005邓宁基因工程生物工程四大领域细胞工程发酵工程酶工程酶工程蛋白质工程细胞工程基因工程发酵工程生物化学工程天然微生物动植物细胞或组织，融合细胞或微生物转基因基因工程菌基因融合与修饰新蛋白质酶制剂或活细胞工业化生物产品或医药、环保、能源、材料等领域的应用微生物工程生物工程六个组成技术之间的关系图解2005邓宁二、动物细胞工程的发展和内容1977年荷兰科学家列文虎克证实了细菌、精子的细胞结构19世纪80年代，德国学者施旺和施莱登提出细胞学说2005邓宁利用离体细胞培养细胞进行的研究发现,通过细胞融合、细胞拆合、核质移植、染色体分离与显微切割和染色体转移技术的应用都可以明显改变一种细胞的遗传性状和生物学特性。这种改变是通过细胞遗传物质的转移、置换而发生的。这些利用培养细胞在细胞水平上改变细胞遗传性状的成功为细胞工程的兴起和发展奠定了基础2005邓宁细胞工程就是应用生物学和分子生物学的方法,在细胞水平进行的遗传操作,改变细胞的遗传特性和生物学特性，以获得具有特定生物学特性的细胞和生物个体的技术。简单地说，它是应用细胞生物学和分子生物学等学科的理论和技术按照人们的需要，有计划地大规模地培养生物组织和细胞以获得生物及其产品，或改变细胞的遗传以产生新的种或品种。组织与细胞培养技术——实验研究、产前诊断、细胞产物。细胞融合技术——单克隆抗体、创造新品种、基因分析。细胞大量培养技术——名贵药物、生物制品。染色体工程技术——创造作物新类型。细胞器移植技术——创造动植物新品种。核质移植技术、体外受精和胚胎移植技术——人类优生、动植物改良基因重组技术外源基因导入技术物理，化学技术细胞工程动植物改良，基因治疗2005邓宁细胞工程细胞整体水平（细胞培养、细胞融合）细胞器水平（核移植，改变染色体倍性和组成）基因水平（外源基因导入）2005邓宁动物细胞工程是建立在动物细胞培养、细胞融合和细胞拆合技术基础上发展起来的。随着基因工程技术、基因转移技术和干细胞工程技术的发展，动物细胞工程在理论和应用两方面获得快速发展。1、动物细胞培养2005邓宁2、细胞融合和单克隆抗体技术20世纪60年代，科学家发现细胞融合现象细胞融合可以在不同细胞间或不同种、不同类型细胞间发生，产生异核体细胞融合技术的最大发展和应用就是杂交瘤技术。2005邓宁2005邓宁三、细胞拆合、核移植和动物克隆细胞拆合把完整细胞的细胞核和细胞质用特殊的方法分离开来，或把细胞核从细胞质中吸取出来，或用紫外线等把细胞中的核杀死，然后再把同种或异种的细胞核和细胞质重新组合起来，培育新的细胞或新的生物个体。细胞重组技术是现代生物工程中瞩目的热点课题，细胞重组结合基因转移可以人为地使细表达新的性状和产生新的产物。2005邓宁芬兰多赛特白羊苏格兰黑面母绵羊核供体卵供体乳腺细胞饥饿培养去核电融合新的卵细胞桑椹胚或囊胚假孕母养多莉2005邓宁克隆羊多莉的诞生第一，它证明了一个已经完全分化了的动物体细胞仍然保持着当初胚胎细胞的全部遗传信息，并且经此技术处理后，体细肥恢复了失去的全能性形成完整个体。这就是说哺乳动物业已分化的细胞不具有细胞全能性的传统概念，在一定条件下是可逆的。第二，多利是世界上首例利用成年哺乳动物体细胞作为供体细胞繁殖的克隆羊，即成体母羊的复制品。第三，在现代生物学领域中，没有任何一项究成果能够比通过对基因进行有规律地控制而解决更多的问题的先例。2005邓宁4、基因转移和转基因动物将特定的目的基因从某一动物或其他生物中分离出来，进行扩增和加工，再导入另一动物的早期胚胎细胞中，使其整合到宿主动物的染色体上，在动物的发育过程中表达，并通过生殖细胞传给后代。这种在基因组中稳定地整合有人工导入的外源基因的动物称转基因动物（transgeneticanimal）。2005邓宁5、干细胞工程和再生医学胚胎干细胞（embryonicstemcell,ES）是从早期胚胎内细胞团（ICM）分离出来的，能在体外培养的一种高度未分化的多能细胞。它与早期胚胎聚集，或注射到胚胎后能参与宿主胚胎的发育，而分化为成体动物的所有组织（包括生殖细胞）。2005邓宁三、动物细胞工程的应用动物细胞工程不仅广泛应用予生物科学各基础学科领域的研究，为生命科学提供从分子水平、细胞水平和整体水平探索生命的遗传控制的有效手段和方法，同时也发展成为生物工程和生物医学产业的主要支柱，为人类改造自然、创造优良生物品种、生产生物药物、保障人类健康展示了广阔的应用前景。2005邓宁1、细胞融合和单克隆抗体的应用细胞融合技术是真核细胞基因表达与分化机制研究的有效途径之一。细胞融合技术中，用的最广的是建立淋巴细胞杂交瘤2005邓宁二、转基因技术的应用转基因技术的是基因结构和功能研究的有效手段。转基因动物提供了一个体内研究基因结构、功能的模型，借助基因工程操作。对目的基因的改造、基因敲除和敲入的研究，是研究基因在发育和疾病中作用的新途径。建立转基因疾病动物模型，入遗传病、病毒性疾病、肿瘤、血液病、老年病、免疫功能疾病、糖尿病等，是研究疾病发生、发展的理想工具。2005邓宁三、细胞治疗干细胞研究证明，胚胎干细胞可定向分化为需要的特殊类型的体细胞，并具有体外增值的能力。将增值的细胞移植到受损的组织，可能修复或取代受损组织、器官。神经干细胞治疗帕金森病，胚胎干细胞治疗遗传性或损伤性骨病。肝干细胞治疗肝病等2005邓宁胚胎干细胞的应用（1）生产转基因动物在细胞水平上进行外源基因整合筛选，ESC中端粒酶具有活性（2）生产克隆动物（3）发育生物学的理想体外模型系统哺乳动物的胚胎在体内发育，正常情况下无法进行跟踪观察（4）医药领域的应用新型药物的发现，筛选细胞，组织和器官的修复和移植治疗或细胞工程的种子细胞2005邓宁主要参考书目：《动物细胞工程》，徐永华，化学工业出版社《细胞工程》，李志勇，科学出版社《医用细胞工程》（第二版），杨吉成等，上海交通大学出版社《培养细胞学与细胞培养技术》，张卓然，上海科学出版社《细胞实验指南》(上下)，D.L.斯佩克特(美)，科学出版社发行处《干细胞技术》，裴雪涛，化学工业出版社《组织培养和分子细胞学技术》，鄂征，北京出版社2005邓宁相关杂志：细胞生物学杂志，中国细胞生物学学会主办，中国科学院上海细胞生物学研究所承办生命科学，中国科学院上海文献情报中心主办细胞与分子免疫学杂志，中国免疫学会和第四军医大学共同主办中国组织化学与细胞化学杂志网站：中国干细胞网邓宁概念：细胞培养，组织培养，原代培养，传代培养，细胞系，细胞株细胞培养实验室必须的设备有哪些？2.培养基必须具有哪些基本条件3.传代培养和原代培养的实验过程4.细胞的冻存与复苏的过程5.细胞污染的检测与预防第二章动物细胞培养2005邓宁二、组织（细胞）培养技术及其历史动物细胞培养(亦称组织培养)既有别于植物细胞培养，又与微生物的培养完全不同.2005邓宁“细胞培养(cellculture)”指的是细胞在体外条件下的生长，在细胞培养的过程中，细胞不再形成，组织；“组织培养(tissueculture)”指的是组织在体外条件下的保存或生长，此时可能有组织分化并保持组织的结构成功能；2005邓宁“器官培养(organculture)”则是指器官的胚芽、整个器官或器官的一部份在体外条件下的保存或生长、此时也能有器官的分化并保持器官的立体结构或功能。2005邓宁(1)细胞培养——细胞(包括单个细胞)在体外条件下的生长称为细胞培养。在细胞培养中，细胞不再形成组织。2005邓宁（2）贴壁依赖性细胞或培养物——由他们繁衍出来的细胞或培养物只有贴附于不定化学作用的物体(如玻璃或塑料等无活性物体)的表面时，才能生长、生存或维持其功能。2005邓宁(3)无菌的——在培养物中不存在真菌、细菌、病毒、支原体或其它微生物。(4)细胞一代时间——单个细胞两次连续分裂的时间间隔．(5)细胞杂交——两个或多4不同的细胞融合，导致一个合核体的形成。2005邓宁细胞系(cellline)原代培养物经首次传代成功后即为细胞系,由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。如果不能继续传代,或传代次数有限,可称为有限细胞系(finitecellline),如可以连续培养,则称为连续细胞系(continiouscellline),培养50代以上并无限培养下去。2005邓宁细胞株(cellstrain)通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性质或标志的培养细胞称为细胞株。从培养代数来讲,可培养到40-50代以上。2005邓宁细胞传代培养方法：分离细胞培养物：从温箱中取出瓶壁上铺满单层细胞的培养瓶，倒掉其中剩余的培养液，先用Hank’s液洗二次，加入胰酶（或EDTA）消化液，放入37C温箱(有的细胞可以不放)，时间可由几十秒至十几分钟，要根据细胞种类而定。2005邓宁悬浮培养物：倒掉消化液，以Hank’s液洗一次，补加新鲜培养液；用弯滴管轻吹瓶壁，使得细胞浮在培养液内根据细胞数量分几瓶，加入培养液继续培养。2005邓宁代：细胞以一个培养瓶移至另一个培养瓶，由此培养液有所稀释，即称为“一代”。2005邓宁（8）克隆——单个细胞通过有丝分裂形成的细胞群体。（9）汇合——指在瓶中培养的细胞彼此汇合形成单层．2005邓宁（10）上皮样细胞——与上皮细胞在形态和外观上相似的细胞称为上皮样细胞．2005邓宁（11）成纤维样细胞——与成纤维细胞在形态上和外观上相似的细胞称为成纤维样细胞．2005邓宁（12）传代——无论是否稀释，将细胞从一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶即称为传代或传代培养（13）原代培养——以直接取自生物体细胞．组织或器官开始的培养2005邓宁（14）群体——在对数时间生长期进计算的细胞增加一倍所需要的时间。如从1.0×106细胞的时间间隔；该术语与细胞干代时间非同义词．2005邓宁（15）群体倍增水平——细胞或细胞株自体外培养开始后其群体倍增的估计次数．计算公式群体倍增量计数=log10（N/N0)x3.3N＝培养瓶中的细胞总数；N0=接种到该培养瓶中的细胞数。2005邓宁（16）异核体——通常由于细胞融合的结果，在同一胞浆内存在遗传性不同的核，而不管它们的数目多久。2005邓宁（17）同核体—通常由于细胞与细胞融合的结果，在共有胞浆内存在遗传性相同的核，而不管它们的数目多少．实际应用时应该通过核型分桥来确定细胞核事实上有相同的核染色体2005邓宁（18）二倍体细胞系（株）——二倍体细胞系（株）内，至少有70％的细胞具有与他来源物种的正常细胞同样的核型。二倍体系（株）的寿命是有限的，如人胚细胞可以传50＋－10代。鸡胚细胞15-35代，小鼠14-