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气泡法测定血清中尿激酶的活性中国现代应用药学2000年第4期第17卷生物化学作者:孟德鸣庄燕黎史炳照单位:上海200437上海医药工业研究院药理室关键词:气泡法;尿激酶;纤溶活性;血清摘要目的:考察气泡法可否用于血清中尿激酶(UK)的活性测定。方法:用气泡法测定加入不同量的血清后尿激酶的活性,以及小鼠静脉注射尿激酶后不同时间血清中尿激酶的活性。结果:随着血清量的增加达终点的时间延长;小鼠静脉注射尿激酶后,10min后仍可检测到尿激酶的活性。结论:气泡法可用于血清中尿激酶活性的测定。DeterminationoffibrinolyticactivityofurokinaseinserumbybubblemethodMengDeming(MengD),ZhuangYanli(ZhuangYL),ShiBingzhao(ShiBZ)(DeptofPharmacology,ShanghaiInstituteofPharmaceuticalIndustry,Shanghai200437)ABSTRACTOBJECTIVE:Tostudywhetherbubblemethodcouldbeusedtodeterminethefibrinolyticactivityofurokinaseinserum.METHODS:Theeffectofamountofserumontheendofreactionwasinvestigatedbybubblemethod,andthefibrinolyticactivityofurokinaseinserumwasdeterminedafterIVdosinginmice.RESULTS:Theendofreactionwasdelayedwhenserumwasadded.AndthefibrinolyticactivityofurokinaseinserumcouldbemeasuredtenminutesafterIVdosinginmice.CONCLUSION:Bubblemethodcouldbeusedtodeterminethefibrinolyticactivityofurokinaseinserum.KEYWORDSbubblemethod,urokinase,fibrinolyticactivity,serum气泡法是中国药典(1995年版)测定尿激酶(UK)效价的方法,本文将其用于血清中UK活性的测定,并考察了血清对测定的影响,为研究UK等促纤维蛋白溶解药在血中的药代动力学特征提供参考。1材料牛纤维蛋白原(凝蛋白83mg/支)、牛凝血酶(50BP单位/支)、牛纤维蛋白溶酶原(8酪蛋白单位/支)、尿激酶标准品(800IU/支)由中国药品生物制品检定所提供。昆明种小鼠及Wistar大鼠由本院实验动物房(沪动合证字107号)提供。2方法与结果2.1溶液的配制参照文献[卫生部药政局,中国药品生物制品检定所编.中国药品检验标准操作规范.北京:中国医药科技出版社,1996∶366]配制6.67mg/ml的牛纤维蛋白原溶液、5.0IU/ml的牛凝血酶溶液、60IU/ml的UK标准品溶液、1.4酪蛋白单位/ml的牛纤维蛋白溶酶原溶液。临用前将牛凝血酶溶液和牛纤维蛋白溶酶原溶液以1∶1配制成混合液。2.2血清对UK活性测定的影响取试管7支,置4℃冰浴,按表1依次加入巴比妥-氯化钠缓冲液、UK标准品溶液、血清及牛凝血酶与牛纤维蛋白溶酶原混合液,立即摇匀后,置37℃水浴中,并分别用秒表记时。当试管中凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时,作为反应终点,立即记时,结果见图1、表1。表1血清对尿激酶活性测定的影响样品号空白对照小鼠血清大鼠血清1234567牛纤维蛋白原溶液/ml0.30.30.30.30.30.30.3巴比妥-氯化钠缓冲液/ml0.50.490.480.470.460.470.46尿激酶标准品/IU30303030303030血清/ml-0.010.020.030.040.030.04牛凝血酶与牛纤维蛋白溶酶原混合物/ml0.40.40.40.40.40.40.4终点时间/min5.277.038.6711.2714.80>40*>40*注:*观察到40min还未达反应终点图1小鼠血清量对气泡法终点时间的影响由图1、表1可知,用气泡法测定UK的活性,加入小鼠血清后的终点时间比空白对照明显延长了,并且终点时间随着小鼠血清量的增加而延长。加入大鼠血清的终点时间比小鼠血清更长。2.3标准曲线的制备取试管4支,置4℃冰浴,按表2依次加入巴比妥-氯化钠缓冲液、UK标准品溶液(60IU/ml)、小鼠血清及牛凝血酶与牛纤维蛋白溶酶原混合液,立即摇匀后,置37℃水浴中(反应系统应在30~40秒内凝集),分别用秒表记时。当试管中凝块内小气泡上升到反应系统体积一半时,作为反应终点,立即记时,结果见表2。以UK的血清浓度(C)的对数对终点时间(t)的对数进行回归,得标准曲线lgt=2.59-0.49lgC,r=-0.9998。表2尿激酶在小鼠血清中的标准曲线样品号1234牛纤维蛋白原溶液/ml0.30.30.30.3巴比妥-氯化钠缓冲液/ml0.790.690.590.49尿激酶标准品/IU0.200.300.400.50血清/ml0.010.010.010.01牛凝血酶与牛纤维蛋白溶0.40.40.40.4酶原混合物/ml血清浓度/IU·ml-11200180024003000终点时间/min12.029.788.527.672.4重现性及回收率取试管1支,置4℃冰浴,依次加入0.59ml巴比妥-氯化钠缓冲液、0.40mlUK标准品溶液(60IU/ml)、0.01ml小鼠血清及0.4ml牛凝血酶与牛纤维蛋白溶酶原混合液,从“立即摇匀”起操作同标准曲线项下。重复测定5次,各终点时间的RSD为6.6%。取试管9支,置4℃冰浴,依次加入适量巴比妥-氯化钠缓冲液、UK标准品溶液、0.01ml小鼠血清及0.4ml牛凝血酶与牛纤维蛋白溶酶原混合液,从“立即摇匀”起操作同标准曲线项下。以标准曲线计算测得量,按测得量与加入量计算UK低、中、高浓度的回收率,结果见表3。表3UK在小鼠血清中的回收率/n=3加入量/IU*ml-1测得量/IU*ml-1回收率/%RSD/%12001255104.67.324002598108.27.730003198106.67.82.5小鼠静脉注射UK后血清中UK活性的测定取小鼠4只,分别以2×106IU/kg静脉注射UK,于1,2,5及10min取血,分离血清,按标准曲线项下自“依次加入巴比妥-氯化钠缓冲液”起,同法操作。根据标准曲线计算不同时间小鼠血清中UK的活性,结果见表4。表4不同时间小鼠血清中尿激酶的活性取血时间/min终点时间/min尿激酶的活性/IU·ml-116.174646.728.752279.3511.051416.31029.97185.2215>60*-注:*观察到60min还未达反应终点由表3可知,UK进入血中后很快被清除,1min时在血清中的活性为4646.7IU/ml,10min时仅为1min时的4.0%,15min后未观察到反应终点。3讨论用气泡法测定UK的活性,加入小鼠血清后的终点时间比空白对照明显延长了,表明血清抑制了UK的活性,而且随着血清量的增加表现得更明显。此外不同动物血清在气泡法测定UK活性中有不同的影响。本文所建立的气泡法测定血清中UK的活性的方法可为研究UK等促纤维蛋白溶解药在血中的药代动力学特征作参考。
本文标题:气泡法测定血清中尿激酶的活性
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