试验十一、抗心肌缺血药物作用研究

试验十一、抗心肌缺血药物作用研究一、目的•了解抗心肌缺血新药的评价原则。•学习心肌缺血动物模型建立方法及评价指标。•观察受试化合物对心肌缺血大鼠的影响，判断其是否具有抗大鼠心肌失常的作用。二、与试验相关的理论知识要点•心肌缺血观察指标与方法心肌缺血，是指心脏的血液灌注减少，导致心脏的供氧减少，心肌能量代谢不正常，不能支持心脏正常工作的一种病理状态。（1）心电图指标观察：皮下放置心电图肢体导联电极，测标准Ⅱ导心电图观察药物对S-T段、T波幅度的影响。（2）形态学观察：1.摘取心脏，用生理盐水冲洗，除去血污，剔除血管脂肪等非心肌组织，用吸水纸吸去水分，称全心湿重。2.沿冠状沟切除右心房和右心室，留下室间隔和左心室，称重。顺房室沟从心尖到心基部平行将狗心室切成1cm厚的心肌片，用生理盐水冲洗干净。3.将心肌片放在1%的氯化三苯基四氮唑（TTC,用pH7.4～7.8的0.2mol/LPBS配制）溶液中，在37℃温孵7min染色,染色过程中不时搅拌染色液使之与心肌有充分接触。4.染色后立即用生理盐水冲洗多余的染料。梗死区不着色，非梗死区被TTC染为红色。5.剪去各心肌片被染色的非梗死区心肌，把未染色的梗死心肌称重，除以左心室重即得梗死范围占左心室重的%。（3）酶学测定：测定血液、心肌组织中的肌酸激酶（CK）、乳酸脱氢酶（LDH）、脂质过氧化产物丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）等指标反应心肌缺血情况。（4）心脏功能及血流动力学试验观测指标应包括冠脉流量，心输出量、左室作功左室内压、左室舒张末期压、左室内压最大变化速率、动脉血压、外周阻力等，进行连续动态观测。（5）心肌耗氧量试验•心肌代谢、特别是氧的供需矛盾，是冠心病的重要病理生理变化，而多数中药常通过降低心肌耗氧量、改善心肌代谢而达到治疗目的。因此，新药对心肌耗氧量的影响，应列为必做项目。•可供选择的试验方法如下1.直接测定：心肌耗氧量测定，心肌组织氧分压测定（可多部位、多层次测定），离体心脏、心肌片或心肌细胞耗氧量测定。2.间接测定：张力时间指数，心肌耗氧指数，正性肌力作用。3.耐缺氧试验：离体心脏或心肺灌流耐缺氧试验，心肌细胞培养耐缺氧试验及其他。三、教学试验安排及内容（一）教学分组在一个教学单元内，根据学生人数，将学生分为8组，每组2～5人，并分成上下两班，4组/班。（二）试验方案•全班均采用异丙肾上腺素造模；•上半班采用A受试物，建议受试物为丹参酮ⅡA磺酸钠；•下半班采用B受试物，建议受试物为丹参注射液。四、试验方法及步骤（一）试验材料试验药品：•乌拉坦（Urethane），生理盐水配制成20%溶液；0.5%异丙肾上腺素（Isoprenaline）；生理盐水，5%葡萄糖注射液。•阳性药：0.2%维拉帕米。•受试物：丹参酮ⅡA磺酸钠，配制成1%、0.2%溶液；丹参注射液，50%葡萄糖配制成含生药1.5g/ml、0.3g%溶液。试验仪器：•生物机能试验系统、紫外、动物秤、大鼠手术台、眼科镊、1ml、5ml注射器、4#、6#针头。（二）试验方法•取大鼠，称体重；•腹腔注射乌拉坦1～2g/kg（20%乌拉坦，5～6ml/kg）麻醉；•仰卧位固定于手术台上,针型电极插入大鼠皮下，打开生物机能试验系统，待心电图稳定后开始试验，先记录一段正常的大鼠心电图；•分组及给药方案如下：上、下半班：•第1组、第5组：静脉注射生理盐水1ml/kg；•第2组、第6组：静脉注射0.2%维拉帕米1ml/kg；•第3组：静脉注射0.2%丹参酮ⅡA磺酸钠；•第7组：静脉注射0.3g/ml丹参注射液1ml/kg，•第4组：静脉注射1%丹参酮ⅡA磺酸钠；•第8组：静脉注射1.5g/ml丹参注射液1ml/kg，5min后，静脉快速注射0.5%异丙肾上腺素溶液1ml/kg，记录大鼠心电图。•注射异丙肾上腺素后，以心电图出现S-T段改变或T波变化为缺血标志。•每次给完一种药后，观察并记录正常、给Iso前和给Iso后1min、3min、5min、10min、15min、20min、30min和60min的T波和S-T段偏移。•将试验结果记录与表格中。（三）试验结果的原始记录表1受试化合物对大鼠T波幅度的影响给药后（mv）组别剂量（mg/kg）给药前（mv）1min3min5min15min30min60min阴性对照组0.2%维拉帕米组受试物高剂量组受试物低剂量组表2受试化合物对大鼠S-T波幅度的影响给药后（mv）组别剂量（mg/kg）给药前（mv）1min3min5min15min30min60min阴性对照组0.2%维拉帕米组受试物高剂量组受试物低剂量组表3受试化合物对大鼠心率的影响给药后（次/min）组别剂量（mg/kg）给药前（次/min）1min3min5min15min30min60min阴性对照组0.2%维拉帕米组受试物高剂量组受试物低剂量组（四）结果分析与讨论•综合8个组的试验结果，判断受试物是否具有抗心肌缺血的作用；•分析中药单体与复方中药在抗心肌缺血中的特点。（五）试验报告内容及格式要求•试验报告内容及格式同前，试验题目由学生自定。注意事项•动物个体较小，固定大鼠时尤其两前肢不宜过紧，以免影响呼吸；•心电图机的针型电极应向心插入皮下，不可插入肌肉内，以免肌电干扰，另外动物周围不要放置金属制品，以免干扰。附：大鼠急性心肌缺血模型（1）将动物注射20%乌拉坦（0.5～0.6ml/100g）麻醉后固定在手术台上（2）用笔型静脉置留针进行气管插管(或切开气管插管)，连接动物呼吸机，参数为：呼吸频率85；呼吸比1：1；潮气量为18ml。剪开气管插管笔型静脉置留针气管插管（3）在胸部左侧3-4肋间剪开皮肤（4）分离肌肉露出肋骨（5）在第三根肋骨下用止血钳将肌肉分离开，然后左手用止血钳挑住肋骨，右手持剪刀剪开第三根肋骨（6）用止血钳将剪断的肋骨夹住掰开，放入开睑器，用止血钳剥离心包膜（7）在左心耳与肺动脉圆锥间穿6-0号线，拉紧丝线，形成心肌缺血，观察线扎紧的部位上下大约2mm范围的心肌发白。（8）结扎术后取下心脏进行TTC染色