基因工程考纲

第一章绪论1.基因工程的定义在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA），转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。2.基因工程的造作路线1)目的基因的获取2)重组体的制备3)转化4)克隆鉴定5)目的基因扩增6)目的基因表达第二章基本操作的主要技术原理第一节核酸的分离与纯化1.DNA的提取主要步骤1)生物材料的准备【选取DNA含量高的组织以及生长期】2)裂解细胞3)分离和抽提DNA4)DNA浓缩例子：大肠杆菌质粒DNA的提取2.RNA分离纯化（主要步骤不作要求）注意事项：RNA比DNA更不稳定，而RNase又无处不在，避免RNA酶的作用1)避免外源RNase的污染：所有用于植被RNA的玻璃器皿均要灭菌处理2)抑制内源性RNase的活性：在破碎细胞的同时加入强变性剂使RNase失活3)在RNA的反应体系内加入RNase的抑制剂第二节凝胶电泳1.电泳基本原理：1)带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率2)电泳迁移率同电厂的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比3)电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比第三章分子克隆工具酶第一节限制性核酸内切酶1.概念：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此处切割DNA双链的核酸内切酶2.识别位点：以环状和线状双链DNA为底物，使两条核糖链上特定位置3,5-磷酸二酯键断开，产生3’-OH基团和5’-p基团片段。3.酶切位点：内切酶可以在识别位点上将DNA的3,5-磷酸二酯键水解断开4.内切酶的反应温度：不同的酶的最适反应温度不同，大多数是37’C，少数要求40-65’C5.内切酶的Star活性某种内切酶在特定条件下，可在不是原识别序列处切割DNA，这种现象称为内切酶的Star活性几乎所有的内切酶均有Star活性Star活性出现的频率因采用的内切酶底物DNA和反应条件不同而不同6.DNA分子片段化（DNA常用的切割方法）：单酶切法、双酶切法、部分酶切法【名词解释】酶切位点、识别序列，以及两者的联系区别内切酶的两种切割方式：粘性末端、平末端内切酶的Star活性第二节DNA连接酶1.DNA连接酶特点：1）被连接的DNA链必须是双螺旋DNA分子2）羟基和磷酸基团之间形成磷酸二酯键是一种耗能反应（大肠杆菌利用NAP+作为能源，动物和噬菌体利用ATP作为能源第三节其他工具酶1.DNA聚合酶包括：大肠杆菌聚合酶（全酶）、Klenow大片段酶、T4DNA聚合酶、T7DNA聚合酶、TaqDNA聚合酶共同特点：具有纠错和聚合的功能（能把脱氧核糖核苷酸连续地加到双链DNA链的3’-OH末端，催化核苷酸的聚合作用）2.碱性磷酸酶特点：能够催化核算分子脱掉5’-p基团，从而使DNA（或RNA）片段的5’-p末端转换成5’-OH末端使用：为了防止线性化的载体分子发生自我连接，移去5’-p基团3.反转录酶第四章第一节分子克隆载体的特点一、【基因克隆载体】：在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫做载体1.克隆载体的DNA分子必须具备的条件：（未完）在宿主细胞内能独立复制有选择性标记有一段多克隆位点，外源DNA插入其中不影响载体的复制分子量小，拷贝数多容易在宿主细胞中分离纯化二、质粒克隆载体1.【质粒】：是独立于染色体以外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子。存在于细菌、霉菌、；蓝藻、酵母等细胞中2.【质粒的不亲和性】：3.构建质粒克隆载体的基本策略（1）能在转化的受体细胞中进行有效的复制，希望在受体细胞中有较多的拷贝数（2）必须含有允许多源DNA片段克隆位点（3）必须含有供选择克隆子的标记基因（4）克隆载体质粒分子尽可能小（5）根据特殊需要，使构建的质粒载体中组装各种：元件“例如：PBR322质粒构建步骤（1）在体内将R1drd19质粒易位子Tn3易位到pMB3（2）缩小pMB3体积，并保留其复制起点：用EcoRI消化pMB3，成为pMB8，pMB8失去了对amp’基因（3）将带有抗药性的DNA片段导入pMB8，EcoRI切割pSC101，然后同pMB8连接形成pMB94.【pUC质粒载体】：是在pBR322质粒载体的基础上，组入了一个在其5’-端带有一段多克隆位点的lacZ’基因，而发展成为具有双功能检测特性的信箱质粒载体系列第二节病毒（噬菌体）克隆片段1.λ噬菌体载体1)性质：λ噬菌体是由DNA和外壳蛋白组成，是温和噬菌体，长度约为48000bp，有61个基因，λDNA上有56种内切酶识别位点2)选用λ噬菌体作为构建克隆载体的依据：λ噬菌体是一种温和噬菌体能承载较大外源DNA片段，λDNA上有20Kb区域对λ噬菌体的生长不是绝对需要的在λDNA上有许多内切酶识别位点3)构建λ噬菌体克隆载体的基本策略a)用内切酶切去λDNA上的非必需区（用EcoRI部分切割λDNA；用点突变或甲基化酶处理，使必需区酶的EcoRI识别位点失效b)在λDNA的必需区内组入选择性标记基因c)构建重组λDNA分子体外包装系统2.柯斯质粒（cosmid载体，粘性载体）1)特征：是一种4-6kb的环形双链DNA，具有λDNA的cos序列和控制包装的序列2)优点：a)具有质粒载体的特性（具有pBR322质粒的复制子、抗药性基因和几个限制性酶的单一位点；有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位点，便于选择）b)高容量的克隆能力（45kb）：兼有了λ噬菌体载体和pBR322质粒载体的优点第五章一、目的基因制备方法（四种大方法，物理化学法中的三个方法原理不用背，其余的原理要记，四种方法使用情况）1.直接分离法（1）内切酶酶切分离法（2）基因分离的物理化学法A.密度梯度离心法B.单链酶解法C.分子杂交法（3）双抗体免疫法分离编码蛋白基因（4）利用酶促反转录法直接从特定mRNA分离基因2.构建基因组文库分离法（1）【基因文库】：某一种生物群体中的全部基因（2）【cDNA文库的构建】A.cDNA：以mRNA为模板逆转录出的DNAB.cDNA文库：利用某种生物的总mRNA合成cDNA，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行繁殖、保存和扩增，称cDNA文库C.构建cDNA文库的一般步骤：a)总RNA提取和mRNA的分离纯化b)cDNA的合成和克隆c)cDNA与载体连接d)噬菌体的包装、转染及质粒DNA的转化两种文库的区别3.利用PCR反应扩增目的基因4.基因的化学合成：磷酸二酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法和自动化合成法【名词解释】基因克隆：指包含某些特定基因或DNA片段的克隆基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用二、从基因文库中筛选目的基因1．目的基因的功能克隆（1）根据特异蛋白分离目的基因原理：（2）功能互补克隆法原理：利用被克隆DNA片段与宿主细胞染色体在功能上有同源互补性来进行目的基因分离2．序列克隆法（1）根据已知基因序列或同源基因序列分离目的基因原理：（核酸探针进行杂交筛选）从GenBank中查找有关基因序列，用该序列做探针筛选基因克隆第六章PCR技术1.PCR技术基本原理（1）【DNA变性】：双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。这些单链正好成为复制新的DNA模板（2）【DNA复性】：人工合成的单链DNA小片段的碱基顺序分别与所要扩增的DNA双链的5’端相同，因而能与模板DNA复性成小段双链，充当体内DNA复制时的引物（类似体内复制过程中的RNA引物）（3）【DNA延伸】：DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链，类似体内的DNA的前导链复制（4）新一轮循环开始：变性—复性—延伸（5）循环的反复理论上25-30次循环就可以合成2的25-30次方循环原因，温度，目的，结果2.影响PCR因素（1）TaqDNA聚合酶A.热稳定性：耐高温，适合在PCR过程中的反复高温变性要求（2）引物（3）模板：纯度、模板量（4）dNTP：02mmol/L，浓度过高会抑制TaqDNA聚合酶的活性并增加错配率（5）Mg2+的浓度：1.5mmol/L的MgCl23.PCR中容易出现的问题以及解决办法（1）假阳性：不应出现而出现A．原因：样品污染、扩增试剂污染、扩增产物交叉污染B．解决办法：隔离工作区、改进操作、避免试剂污染（2）假阴性：该出现不出现A．原因：DNA样品中含有Taq酶抑制剂、DNA样品中含有重金属等B．解决办法：第七章目的基因导入受体细胞第一节受体细胞以及重组体分子导入受体细胞1.受体细胞2.受体细胞选择原则（九个，未完）（1）便于重组DNA分子导入（2）能是重组DNA分子稳定存在于细胞中（3）便于重组体的筛选（4）遗传稳定性高，易于扩大培养或发酵生长（5）安全性高、无致病性3.重组质粒DNA分子转化大肠杆菌转化：重组质粒DNA分子通过与膜蛋白结合进入受体细胞，并在受体细胞内稳定维持和表达的过程4.重组DNA分子转入真核细胞（1）重组DNA分子导入植物细胞A．农杆菌介导的Ti质粒转化法B．DNA直接转移法：（一句话简述原理）多聚物介导法：聚乙二醇等可以试细胞膜间接触粘连、电荷紊乱、有利于细胞膜间融合和外源DNA进入显微注射法：电穿孔法：激光微束穿孔法：激光束引起细胞膜可逆性穿孔脂质体介导：花粉管通道法：基因枪法：超声波：第二节：重组子的筛选1.转入受体细胞方法，（农杆菌介导法，DNA直接转移法）、外源基因导入受体方法（知道名称，大概原理）2.重组子的筛选：（1)直接筛选法，原理（2)根据重组子结构特征分析筛选法（3)利用PCR筛选什么叫探针，探针标记物，理想标记物满足五个条件八、基因表达机制，蛋白质合成分子的基础，表达蛋白在细胞中的稳定性（定义：融合蛋白，包涵体，分泌蛋白），什么叫基因沉默