文章-子宫增重法筛选中药植物雌激素

1用小鼠子宫增重法筛选淫羊藿等十味中药雌激素样作用的实验研究*赵丕文王大伟王玲巧牛建昭**王继峰（北京中医药大学北京100029）【摘要】目的：通过研究淫羊藿等十味中药对小鼠体重及子宫发育的影响，探讨它们的雌激素样作用。方法：正常昆明种雌性小鼠121只，体重9～12g。随机分为12组（溶剂对照组、阳性对照组和10个中药组），每组9～11只。各组给药4天，于第五天处死动物，之后迅速剥离子宫称取湿重，计算子宫系数；同时，观察小鼠体重在给药前后的变化情况。结果：（1）灌胃淫羊藿能使小鼠的子宫系数明显升高；灌胃肉苁蓉和补骨脂可使动物的子宫系数有所下降；统计学分析表明均有显著性差异（P＜0.01）；（2）灌胃淫羊藿使小鼠体重增长速度显著升高（P＜0.01）；灌胃枸杞也可促进小鼠体重增长加速，灌胃肉苁蓉和补骨脂可使小鼠体重增长减慢，但无显著性差别（P＞0.05）。结论：淫羊藿能刺激小鼠子宫发育，促进其体重增长，具有一定的植物雌激素活性；肉苁蓉和补骨脂对小鼠子宫发育有一定的抑制效应，其作用机理及其有效成分均需进一步探讨。【关键词】植物雌激素、小鼠、子宫系数、体重、淫羊藿植物雌激素（phytoestrogens）是天然存在于一些植物中、具有雌激素效能的化合物。【1】这些化合物通过与体内雌激素受体（estrogenreceptor，ER）结合，发挥其雌激素活性。因子宫组织含有丰富的ERs，所以上述化合物可通过与ERs结合诱发细胞内反应，使子宫的雌激素诱导蛋白含量增加，从而刺激子宫的生长。因此，子宫增重实验可用于对植物雌激素进行初步筛选。【2】长期以来，许多中草药及其复方被广泛应用于妇科病的治疗和保健。中药所含植物雌激素在其中发挥的药效作用不容忽视。【3】在本实验中，我们分别对淫羊藿等十种中药——包括淫羊藿、红花、女贞子、枸杞、甘草、肉苁蓉、补骨脂和菟丝子等八种补益药及川牛膝、丹参等两种活血化瘀药【4】进行了筛选，探讨了其雌激素样的作用及其强度。同时，我们也观察了用药前后小鼠体重增长速度的变化。【材料和方法】1、实验材料1.1实验动物昆明种小鼠121只，雌性，出生后21天（刚断乳），体重9-12g，购自维通利华实验动物中心。实验期间饲喂在二级动物室，温度（25±1）℃。1.2药物红花、女贞子、枸杞、甘草、肉苁蓉、淫羊藿、补骨脂、菟丝子、川牛膝、丹参等十种中药为免煎剂，江阴天江药业有限公司生产，购自东直门医院中药房。实验时用双蒸水溶解，浓度为25g生药/100ml水。阳性药物为己烯醇酚，北京益民药业有限公司生产，配制成3mg/100ml水的悬浊液。1.3仪器电子读数分析天平；普通手术器械。2、实验方法*本课题属于国家自然科学基金（No.30371775），北京市自然科学基金（No.7032024）资助项目，国家中医药管理局科研课题，02-03ZP07.2**责任作者2.1分组将实验动物按体重均衡和随机的原则分为12组：正常对照组、阳性对照组以及十个中药组。2.2给药方法实验动物到达后适应性饲养6天，开始实验。正常对照组给予等体积蒸馏水；阳性对照组按0.35mg/10g体重/天给药；十个中药组按30mg生药/10g体重/天给药。灌胃分早、晚两次进行，给药均持续4天。3、指标观察3.1取材、称重各组动物于最后一次给药后第二天称重，断颈处死后迅速抛开腹腔，分离、剪下子宫称重；计算子宫系数（即：子宫湿重/体重×100%），并计算给药前后体重变化率。3.2数据统计实验结果均用x±s表示，用t检验进行统计学处理。【结果】1、淫羊藿等十种中药对性未成熟小鼠子宫湿重的影响实验结果如表1所示：表1淫羊藿等十种中药对性未成熟小鼠子宫系数的影响（x±s）组别数目（只）体重（克）子宫湿重（克）子宫系数（%）阴性对照组1118.727±2.1370.022±0.0060.116±0.027阳性对照组1120.955±2.3390.119±0.0290.566±0.116★红花组1019.300±1.73500.021±0.0040.107±0.022川牛膝组1119.500±0.7070.023±0.0090.119±0.043丹参组1119.364±2.1810.024±0.0070.126±0.034女贞子组1019.250±1.4770.020±0.0050.106±0.026枸杞组1020.650±0.9730.021±0.0050.099±0.021甘草组920.389±1.8500.019±0.0070.093±0.026肉苁蓉组922.111±1.3870.018±0.0050.081±0.021★淫羊藿组1018.950±1.2120.031±0.0090.157±0.038★补骨脂组1019.250±1.6370.012±0.0030.062±0.015★菟丝子组921.389±1.2690.021±0.0080.120±0.0393图１　淫羊藿等十种中药对对性未成熟小鼠子宫系数的影响（注：与溶剂对照组相比，★表示P＜0.01）0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.800溶剂对照组阳性对照组红花组川牛膝组丹参组女贞子组枸杞组甘草组肉苁蓉组淫羊藿组补骨脂组菟丝子组组别子宫系数（%）▲▲▲▲★▲★▲★▲▲▲▲★统计学分析结果显示，在十种中药当中，淫羊藿可使动物子宫系数明显升高，与溶剂对照组相比有极显著的差异；而肉苁蓉和补骨脂两种中药可使动物子宫系数较阴性对照组有所下降，组间也有极为显著的差异。同时，所有药物诱导子宫系数变化后的数值与阳性对照组之间均存在极为显著的差异。2、淫羊藿等十种中药对性未成熟小鼠体重增长速度的影响实验结果如表2所示：表2淫羊藿等十种中药对性未成熟小鼠体重增长速度的影响（x±s）组别数目（只）用药前后体重增幅（%）阴性对照组1021.16±7.30阳性对照组1030.41±5.13★红花组1021.42±5.84▲川牛膝组1123.43±6.30△丹参组1123.39±9.37△女贞子组1020.47±4.79▲枸杞组1025.72±5.27甘草组925.07±4.14△肉苁蓉组917.01±7.42▲淫羊藿组942.83±20.99★补骨脂组1016.18±4.89▲菟丝子组916.57±7.15▲4图2淫羊藿等十种中药对性未成熟小鼠体重增长速度的影响（注：与溶剂对照组相比，★表示P＜0.01；与阳性对照组相比，△表示P＜0.05，▲表示P＜0.01）0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.700溶剂对照组阳性对照组红花组川牛膝组丹参组女贞子组枸杞组甘草组肉苁蓉组淫阳霍组补骨脂组菟丝子组组别用药前后小鼠体重增幅（%）▲▲△△△▲▲★▲★▲统计学分析结果显示，淫羊藿使动物体重增长速度有明显升高，与阴性对照组相比有极为显著的差异，而与阳性组相比无显著性差异。枸杞组动物虽体重增幅有所提高，但与阴性对照组相比无显著性差异。【讨论】应用动物实验——小鼠子宫增重法检测药物的雌激素活性是一种最常用的评价雌激素作用的方法。【2】此方法经济、方便、省时，灵敏度高，某些需要在体内代谢、活化才有雌激素活性的物质和中间代谢产物也可用本方法检测。其原理主要是子宫含有大量的雌激素受体（ERs），雌激素或具有雌激素活性的化合物通过与该受体结合，可诱发细胞内反应，使子宫的雌激素诱导蛋白（IPs）含量增加，表现为子宫组织增生。为尽量减少内源性雌激素的分泌对实验结果产生的影响，本实验选用的是刚刚断乳、性未成熟的雌性小鼠，以子宫湿重与体重之比作为评价雌激素活性的指标。同时，为减小误差，在实验操作中必须严格、规范，剪开腹部皮肤取子宫时，应迅速分离周围组织，在吸干表面液体后立即称重、读数，全部过程由一人操作，使子宫从剥离到称取重量的间隔时间尽量短暂，而且保持一致。植物雌激素的作用具有双向性【5】，表现在：既具有一定的雌激素作用，也可呈现雌激素拮抗剂的特点，并具有种属特异性，这些生物学效应与它们和不同类型ER的亲和力差异有关【1】。从上述实验结果中可以看出，淫羊藿诱导的子宫增重效应与溶剂对照组相比有明显升高，差异极为显著。这与文献报道淫羊藿或淫羊藿提取物具有雌激素样作用是相一致的【6】【7】。另外，曾有文献报道，肉苁蓉能增强下丘脑-垂体-卵巢的促黄体功能，使大鼠子宫重量比对照组明显增重【8】；补骨脂干粉可使去卵巢雌鼠的子宫重量明显增加【9】。这些中药发挥雌激素样作用、使子宫重量增加的主要机制是：通过与子宫组织ERs的结合，激活雌激素应答元件（ERE）、增加靶蛋白的表达而使子宫重量增加。但雌激素的上述效应要受到多种因素的影响，如：种属、靶器官功能状态、年龄、剂量、方式、时间及活性代谢产物等都可以影响这一效应的发挥【10】。在本实验所采用的动物（小鼠）、鼠龄（25天左右）、用药剂量和用药持续时间等条件下，肉苁蓉和补骨脂二者引起的子宫增重效应低于溶剂对照组，统计学分析表明二者也有显著的差异，说明在本实验条件下，肉苁蓉和补骨脂不但不能诱导子宫ER的活化或其数量的增加，可能还通过一定的途径（如通过抑制ER）对子宫组织增生产生抑制作用，提示我们在用药时必须全面分析考虑。以上药物发挥作用的分子机制也有待进一步阐明。长期以来，植物雌激素在防治骨质疏松和心脑血管系统疾病、缓解更年期妇女综合征、5抗癌等方面的作用受到了人们广泛的关注，在理论和临床上也进行了比较深入的研究。而植物雌激素对动物生长的影响只是近年来才受到重视。已有研究表明：异黄酮植物雌激素能明显促进动物的生长【11】。其原因一是通过直接作用于肌肉细胞的雌激素受体，显著促进动物肌肉蛋白质积累、使肌细胞增大，还可促进肝脏蛋白质合成，使血清白蛋白等含量升高【12】。另外，研究还发现植物雌激素在作用于动物性腺轴的同时也作用于其生长轴，它可通过与下丘脑、垂体等部位雌二醇受体结合，降低生长抑素水平，从而提高GH水平，并上调肝脏GH受体，使IGF-1水平升高，促进动物生长【11】。因此，从影响动物生长的角度，也可反映出所用药物的雌激素样活性。从本实验的结果中可以看到，在各组动物用药前后体重增幅的统计结果中，淫羊藿组动物在用药前后的体重增幅与溶剂对照组相比有极显著的提高，而与阳性对照组相比没有显著性差异。枸杞组动物的体重也有一定幅度的升高，但与溶剂对照组相比尚无显著性差异。同时，从实验结果中也可看到肉苁蓉和补骨脂引起的动物体重增幅低于溶剂对照组，但无显著性差异，可能与用药时间较短有关。但因体重增幅在整体实验中易受到较多因素的影响，而且本实验用药持续时间相对较短，我们下一步将在本实验对十种中药的雌激素样作用进行初步筛选的基础之上，通过更加直接、针对性更强的体外细胞培养并结合报告基因技术进一步对其分子机制加以分析和探讨。【参考文献】〔1〕陈慧.植物雌激素与雌激素相关性疾病.国外医学内分泌学分册.2000，20（4）：208-211〔2〕ShelbyMDetal.Assessingenvironmentalchemicalsforestrogenicityusingacombinationofinvitroandinvivoassays.EnvironHealthPerspect.1996,104:1296-1300〔3〕贺红利，等.雌激素受体调节剂及其相关重要的研究进展.中国中药杂志.2002，27（11）：805-807〔4〕张晓晖,等.植物雌激素与中药研究.中药新药与临床药理.2002，13（4）：261-264〔5〕CollinsBM,MclachlanJA,ArnoldSF.Theestrogenicandantiestrogenicactivitiesofphytochemicalswiththehumanestrogenreceptorexpressedinyeast［J］.Steroids,1997,62:365〔6〕叶海涌，刘健，楼宜嘉.淫羊藿苷衍生物的制备及其雌激素样作用研究.浙江大学学报（医学版).2005，34（2）：131-136〔7