油浸镜的使用和细菌形态结构的观察

-35-实验一油浸镜的使用和细菌形态结构的观察Useofoilimmersionobjectiveandobservationofmorphoiogystructureslfbacteria一、油浸镜的使用方法观察细菌时，须用放大倍数最大的物镜，即油浸镜（Oilimmersionobjective，简称油镜）。其原理如图一所示，当光线从标本经过空气进入镜头时，由于介质密度不同而发生光的折射（散光现象），光线不能完全进入物镜中，致使物象显现不清。若在油镜与载物玻片中间加入和玻璃折射率（n=1.52）相仿的香柏油（n=1.515），则不使通过的光线有所损失，视野亮度增强，获得清晰物象。(一)油浸镜的使用方法1、双手托显微镜，轻拿轻放。2、放好后，用绸布擦试显微镜，同时检查显微镜有无问题，有问题立即向老师报告。3、用低倍镜调整光线，看染色标本时，要求视野达到最亮的程度。①将集光器升到最高位置，与载物台相平。②将虹彩完全开放。③天然光线用平面反射镜，人工光源用凹反射镜。使视野达到最亮的程度。4、在标本上滴一滴香柏油，不要多加。用眼睛从侧面观察，小心转动粗调节器，使油浸镜头缓慢下降，浸入油中，到几乎或轻轻与玻片接触为止。不能过急过重，以免碰坏镜片。5、一面从目镜观察，一面用粗调节器慢慢上升油浸镜头，当见到模糊的物象时，立即停止。再用细调节器调到物像清晰为止。然后，一边移动片子，一边观察，寻找理想的视野，仔细观察。6、看完后，先将油浸镜头上提，然后取下标本片，再用擦镜纸拭去镜头上的香柏油。必要时，用擦镜纸蘸少许二甲苯擦拭镜头，然后再用另一小块擦镜纸拭去二甲苯。7、最后，降下集光器，竖起反射镜，下降镜筒使物镜成八字形抵于载物台绸布上，双手托持显微镜，放入显微镜箱中。(二)注意事项1、不得在直射阳光下操作显微镜，以免强光损坏镜片。2、显微镜的细调节器是精密而脆弱的机件，只能做有限的旋转，因此，不得向一个方向连续旋转数周。当旋转时感到有阻力，则表明已达极限，不能再继续向上方旋转，必须立即退回，轻拿轻放，防止细调节器因震动而损坏。3、显微镜必须保存于干燥、无尘的方，以防镜片发霉损坏。二、细菌的基本形态、特殊构造的观察细菌的基本形态（球菌、杆菌、螺形菌）和细菌的特殊构造（荚膜、鞭毛与芽胞等）都图1油浸镜原理示意图-36-可以在染色之后，用油浸镜观察(一)细菌的基本形态观察注意观察细菌的形态、大小、排列和染色性。1、球菌和杆菌（葡萄球菌和大肠杆菌）革兰氏染色标本，葡萄球菌染成紫色，大肠杆菌染成红色。2、弧菌（霍乱弧菌）革兰氏染色标本，霍乱弧菌染成红色。(二)细菌的特殊构造观察1、荚膜（肺炎球菌）Hiss氏荚膜染色法，菌体染成紫色，荚膜染成淡紫色或无色。2、鞭毛（变形杆菌）户田氏鞭毛染色法，菌体和鞭毛均染成红色。3、芽胞（破伤风杆菌）Moeller氏芽胞染色法，菌体染成兰色，芽胞染成红色。三、细菌大小的测定细菌及其它一些微生物的大小，通常用测微计来测量，测微计分接目测微计与镜台测微计二种，接目镜刻度是相对的，在同一接目镜下，它是随着不同放大率的接物镜而改变相对比例，而镜台测微计上所刻的长度是绝对的用来校正接目测微计每格所代表的大小。材料：光学显微镜、接目测微计、镜台测微计。方法：1、将接目测微计装入接目镜内的横隔上，刻度向下，置镜台测微计于镜台上。2、在接目镜下寻镜台测微计的刻度（这时光圈宜小，因光线暗才能使刻度更为清楚。需要用那一放大率的接物镜观察标本，则在校正接目测微计时就用那一个接物镜头。3、移动镜台测微计和转动接目测微计使二者刻度平行，并使二者的起始线相重迭，数出二条重迭线之间在两个测微计上的格数即可求出接目测微计每格的长度。接目测微计与镜台测微计二个重迭点间的距离越长，则所得的数字越精确。4、接目测微计每格长度的计算：镜台测微度总长度为1毫米，其上刻有10大格，每格划有10小格，所以每小格=1/100=10μm（因为1mm=1000μm）。例：今测得高倍显微镜（油镜）的接目测微计50格相当于镜台测微计7格，则接目测微计每格长度为：格/4.150107mm5、校正后移去镜台测微计，将细菌玻片标本置于镜台上，找到目的物后，移动接目测微计（或移动标本），测定细菌长与宽各占儿格，求得其大小。细菌的大小=测得之格数×接目测微计每格长度。6、实验完毕后，取出接目测微计，其中如有油腻或手印，则用擦镜纸拭净。-37-实验二常用培养基的制备和常用热力灭菌器及使用方法Preparationofcommonculturemediumandsterizationmethodsbyheat一、常用培养基的制备培养基是用人方法将多种营养物质按微生物生长需要配成的一种营养基质。常用的培养基有基础培养基、营养培养基、选择培养基、鉴别培养基、厌氧培养基等。其制备步骤大致是：按一定配方称取各种物质、溶解、修正pH，分装在一定的容器内，灭菌。使用前保证无菌状态。常用的培养基有下列几种，简介其制备方法和用途。(一)肉汤培养基材料：肉膏0.5g蛋白胨1.0gNacl0.5g蒸馏水100ml方法：1、将上述材料混合，加热溶解，放凉。2、用精密pH试纸试酸碱度，用10％碳酸钠（Na2CO3-）或1N氢氧化钠（NaOH）矫正pH为7.2左右。过碱时可用10％醋酸或1N盐酸矫正。必要时可用比色箱或酸度计更准确地测定酸碱度。3、分装于试管中或放三角烧瓶中，用15磅高压蒸气灭菌20-30分钟。待用。用途：主要用于增菌和观察细菌在液体培养基中的生长状态（沉淀生长、混浊生长和表面生长）。(二)营养琼脂培养基材料：合成营养琼脂4.8g（视制剂说明）蒸馏水100ml方法：混合，加热溶解，勿需调pH。分装于试管和三角烧瓶中，一并高压灭菌。灭菌后，将试管倾斜放置，冷却后则成斜面培养基；三角烧瓶中的培养基趁热倒入灭菌平皿中，冷却后即成琼脂平板。用途：琼脂平板用于分离细菌等；琼脂斜面用于细菌纯培养和菌种保存等。(三)血液琼脂培养基材料：营养琼脂培养基100ml脱纤维的新鲜羊血或兔血5-10ml方法：将营养琼脂加热溶化（或高压灭菌后），待冷即到50℃左右时，无菌操作将羊血或兔血加入后混匀，分别注于无菌平皿或试管中，制成血平板或血斜面。用途：供培养要求较高的细菌。-38-(四)半固体培养基材料：合成半固体培养基1.0g（视说明）蒸馏水100ml方法：混合，加热煮沸溶解，分装于小试管中，高压灭菌后，直立，使之凝固成高层。用途：供测定细菌的动力和保存菌种。(五)蛋白胨水培养基材料：蛋白胨1.0gNacl0.5g蒸馏水100ml方法：1、按量称取后混合加热溶解。2、矫正pH为7.2-7.6。3、分装后高压灭菌。用途：蛋白胨水中不含糖类，常用于制备糖发酵培养或用检查细菌的靛基质反应等。二、常用热力灭菌器及其使用方法（示教）高温能使微生物蛋白质凝固变性，故高温能杀灭所有的病原微生物。在医学实践中常用下述热力灭菌。(一)干烤箱（干热灭菌器）干烤箱是用两层金属板制成的箱子，中间充以石绵，箱底有热源（电炉），并附有温度计和自动调节器。灭菌时，打开通气口，加热到80℃时，关闭通气口，加热到160-170℃时，保持两小时，即可灭菌。最高温度不得超过180℃，超过180℃则棉塞和包装纸会被烤焦。灭菌后，待温度下降到40℃以下，再开箱取物，防止玻璃器材因骤冷而破裂。耐高热和干烤的玻璃器材、磁器等常用此法灭菌。如培养细菌用的试管平皿、吸管等，经清洗和晾干之后，进行干热灭菌。为了使灭菌后的器材保持无菌状态，烧瓶和试管要塞上棉塞，平皿和吸管要放入特制的筒内或用纸包好再行灭菌。(二)流通蒸汽消毒器实验室常用的流通蒸汽消毒器，其原理和一般的蒸锅相同。消毒时，用流通蒸汽（100℃）蒸30分钟，可消毒用过的细菌培养物和病人的衣物等。100℃30分钟，不能灭尽芽胞，达不到灭菌的要求。一些不耐高热的含糖或牛奶培养基，可用流通蒸汽消毒器进行间歇灭菌，即每天100℃30分钟，连续进行三天；不加热时，把培养基放在室温中，使其中的芽胞发育成繁殖体，于次日加热时将其杀死。(三)高压蒸汽灭菌器高压蒸汽灭菌器是一个能密闭的耐高压的金属圆简，附有加水、贮水、排水、加热、排汽活门、安全活门和压力计等装置。小型的手提式高压蒸汽灭菌器，结构简单，使用方便。高压蒸汽灭菌器的使用方法如下：1、先向筒内注水，然后把要灭菌的物品装入内筒，再把盖拧紧，打开排气活门，开始加热。-39-2、水沸腾后，排气活门开始排出气体，待筒内冷空气全部排出后，关闭排气活门。此时筒内压力逐渐上升。3、待筒内压力达到所需磅或公斤数时，调节热源，维持一定时间，一般是15磅（温度为121.3℃）20-30分钟，即可达到灭菌的目的。4、达到灭菌所需时间后，关闭热源，自然放凉，待压力表指针下降到“0”时，方可开盖取物。使用高压灭火器灭菌，是最有效而又迅速的方法。凡不怕高热的普通培养基、药品、手术器械、外科敷料等，均可用此法灭菌。为保证灭菌效果和安全。器内要加入足量的水，装入的物品不要过挤，冷空气必须排尽，注意压力表的工作情况，防止因压力表失灵而造成事故。-40-实验三细菌的培养法和细菌的分布BacterialcultureandBacterialdistribution一、细菌的培养法根据培养基的物理性状（液体、固体、半固体）的不同，培养方法也不同。常用的培养方法有：平板培养法、斜面培养法、高层培养法和液体培养法。材料：琼脂平板、琼脂斜面、半固体高层和肉汤培养基，大肠杆菌、枯草杆菌的培养物等。方法：1、平板培养法（分离培养法）：临床上常用的检验标本，如粪、痰、脓汁等中常混有多种菌。欲从病人标本中检出某种病原菌时，必须先将各种菌分开，获得纯菌，然后再做进一步鉴定，这样才达到目的。琼脂平板面积大，通过一定的方法进行培养，则可达到分离各种细菌目的。平板培养法种类很多，现将三段划线法介绍如下：①将接种环火焰灭菌后，取检查材料，反复涂于平板上端。②将接种环火焰灭菌后，把涂于平板上端的材料，划线于“1”区。③将接种环火焰灭菌后，把“1”区部分材料划线于“2”区。④将接种环火焰灭菌后，把“2”区部分材料划线于“3”区。⑤划线完了后，盖好平板，灭菌接种环。⑥于盛琼脂的底面玻璃上注明日期和姓名，放37℃培养18-24小时。2、斜面培养法：斜面培养基不易污染，常用于培养纯种细菌（纯培养）。①先将接种环灭菌，然后挑取平板上弧立菌落上的细菌。②拔去斜面培养基的棉塞，试管口经火焰灭菌，将沾有细菌的接种环伸入管内，自下而上划一直线，然后将接种环再自下而上，连续平行划线。③接种后，管口在火焰上灭菌，塞好棉塞。④灭菌接种。在试管上写好菌名，日期。⑤37℃培养18-24小时。3、液体培养法：用于增菌，并可观察细菌的生长状态和检查生化反应。①用灭菌接种环取少许纯菌。②按无菌操作要求，将沾有细菌的接种环伸入液体培养管中，在稍高于液面的管壁上，轻轻研磨，使细菌落入液体培养基中。③接种后，管口在火焰上灭菌，塞好棉塞。④灭菌接种环，在试管上做好标记。⑤37℃培养18-24小时。4、半固体培养法（穿刺培养法）：常用以检查细菌运动或检查细菌发酵能力。①用灭菌接种环（白金针）取少许纯菌。②按无菌操作要求，将沾有细菌的接种针，从半固体培养基的正中刺向管底，但不到底，-41-留有0.5厘米左右。然后，按原线抽出。③④⑤同上。二、细菌的分布细菌种类繁多，繁殖迅速，分布广泛。不论空气、土壤、水、食物、各种物体和器械的表面，以及动物和人体与外界相通的腔道中都有细菌存在。因此，了解细菌在自然界及正常人体中的分布，对于在医疗实践与某些科学实验中树立无菌观念有着重要的意义。(一)空气细菌的检查材料：普通琼脂平板。方法：将普通琼脂平板置于室内不同地方，打开盖子，暴露于空气中5-10分钟，盖好，放37℃温箱，培养24小时。结果：观察平板上菌落的数目。(二)土壤中细菌的检查材料：地表土壤，肉汤培养基。方法：取少量土壤放入肉汤培养基内，37℃培养24小时。结果：观察细菌生长状况。(三)手指等的细菌检查材料：普通琼脂平板。方法：将手指、钱币、衣物等直接涂于琼脂平板上，