高通量基因测序原理及操作流程培训

测序原理及流程原理流程图原理I.杂交：利用碱基互补原理，通过退火将anchor结合于测序样品末端的已知序列；II.连接：随后在T4ligase的作用下，使与待测位点碱基互补的荧光探针与anchor连接并与样品互补结合；III.收集信号：收集与样品结合后的荧光探针在特定激发光下发出的荧光信号，由荧光信号的种类确定样品上所测位点的碱基种类。Beads5’DNA3’Beads5’DNA3’AnchorAnchorProbeBeads5’DNA3’AnchorProbe信号收集确定碱基荧光信号Beads5’DNA3’AnchorProbeNaOHCutBeads5’DNA3’Beads5’DNA3’NewAnchornextcycle流程图杂交退火将anchor结合于样品末端连接T4ligase的作用使与待测位点碱基互补的荧光探针与anchor连接并与样品互补结合信号收集收集与样品结合后探针在特定激发光下发出的荧光信号杂交2×SSPE28℃，Wash60℃，30sLoadAnchor42℃，2min结合连接25℃连接Reactionbuffer25℃，WashLoad：T4LigaseProbeReactionbuffer30℃，10minWashingbuffer2×SSPE30℃，Wash采图信号收集采图完成后25℃Load：1XNaOHLoad：2×SSPE25℃洗脱结束，进入下cycle测序过程的总结1、3步骤：杂交；连接；信号收集。2、常用酶：T4连接酶（30℃）。3、2种滤光片：绿色滤光片—CY3；黄色滤光片—TR。4、4种反应Buffer：2×SSPE；ReactionBuffer；1XBufferN（NaOH）；WashingBuffer5、1Base，2Cycle：Cycle1—A(TR)、G（CY3）；Cycle2—C（TR）、T（CY3）。