05荧光分析法

物质对特定波长的光产生有选择性的吸收光谱，其电子能级跃迁到激发态。处于激发态的分子或原子是不稳定的，很容易通过碰撞，以热能或动能的形式消耗其能量，降低到较低能级。这种能级的变化称为无辐射跃迁。有些物质则会发射一定波长的光，以辐射的形式回到基态。这种现象称之光致发光。荧光（fluorescence）和磷光是光致发光现象中最常见的现象。荧光分析法是根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。荧光按待测物可分为：分子荧光和原子荧光荧光（fluorescence）和磷光是光致发光现象中最常见的现象。荧光分析法是根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。荧光按待测物可分为：分子荧光和原子荧光1575年，西班牙医生N.Monardes发现。1852年，SirGeorgeStokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”。1867年，首次用于分析测定。1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。1952年，商品荧光分光光度计出现。荧光分析法的发展历史11.2荧光分析法的基本原理11.2.1分子荧光光谱的产生1分子荧光与电子能级的多重性电子的自旋量子数根据Pauli不相容原理，基态时，填充在低轨道的两个电子必定具有相反的自旋方向，即自旋量子数S分别为1/2和-1/2。总自旋量子数S=1/2+(-1/2)=0（自旋相反）S=1/2+1/2=1（自旋相同）电子能级的多重性电子能级的多重性用M＝2S+1表示，其中S是给定轨道的电子的总自旋量子数。总自旋量子数S——为单个价电子自旋量子数的式量和。单重态当S=0时，分子的多重性M=1，此时电子所处的电子能态称为单重态（sigletstate),用符号S表示。三重态当S=1时（即自旋平行，分子的多重性M=3，此时分子所处的电子能态称为三重态（tripletstate),用符号T表示。激发单重态：当基态的一个电子吸收光能激发跃迁至较高的能级时，若电子不发生自旋方向的改变，即两个电子的自旋方向仍相反，总的自旋量子数仍等于0，这时分子处于激发单重态（2S+1=1）。激发三重态当基态的一个电子吸收光能激发跃迁至较高的能级时，若电子发生自旋方向的改变，即两个电子的自旋方向相同，总的自旋量子数等于1，这时分子处于激发三重态（2S+1=3）。分子的基态、激发单重态、激发三重态的电子分布物质的分子体系中存在着电子能级（Ee）、振动能级（Ev）和转动能级（Er）。在室温时，大多数分子处在电子能级基态的最低振动能级，当物质受到一定辐射能的作用时，就会发生能级间的跃迁。2.荧光产生机理激发态→基态的能量传递途径传递途径辐射跃迁荧光磷光内转换外转换系间跨越振动弛豫无辐射跃迁振动弛豫振动弛豫（VibrationalRelaxation,VR）是指处于激发态的各振动能级的分子，通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。在这一过程中能量以热的形式放出，故为无辐射跃迁。振动弛豫只能在同一电子能级内发生，发生振动弛豫的时间为10-12s数量级。内转换（InternalConversion，IC）当两个电子能级非常靠近以至其振动能级有重叠时，受激分子常由高电子能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。如图中，S1*较高振动能级与S2*的较低振动能级的势能非常接近，则内转换过程（S2*→S1*）很容易发生，通过内转换及振动弛豫，均跃回到第一激发单重态的最低振动能级。内转换荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（多为S1*→S0跃迁），发射波长为3的荧光；10-7～10-9s。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长；32；荧光发射：外部能量转换（ExternalConversion，EC）受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称“熄灭”或“猝灭”。常常发生在第一电子激发单重态或激发三重态的最低振动能级向基态转换的过程中。外部能量转换体系间跨越（IntersystemConversion，ISC）处于激发态分子的电子发生自旋反转而使分子的多重性发生变化的过程，如从S1＊到T1＊，该跃迁是禁阻的。然而，当不同多重态的两个电子能级有较大重叠时，处于这两个能级上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁（S1＊→T1＊），该过程称为系间跨越。体系间跨越磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级→基态（T1*→S0跃迁）；发光速度很慢：10-4～10s。光照停止后，可持续一段时间。磷光发射：过程小节：非辐射能量传递过程振动弛豫内转换外转换系间跨越辐射能量传递过程荧光发射磷光发射11.2.2荧光的激发光谱和发射光谱蒽的激发光谱（吸收光谱）和发射光谱（荧光光谱）如何获取谱图？固定测量波长，改变激发光波长，记录荧光强度（F）对激发波长（λex）的光谱曲线——激发光谱。保持激发光波长和强度不变，通过发射单色器扫描，记录荧光强度（F）对发射波长（λem）的光谱曲线——发射光谱。激发光谱与发射光谱的关系吸收光谱发射光谱Stokes位移：分子荧光的发射峰相对于吸收峰位移到较长的波长。由于内转换和振动弛豫损失能量，是主要原因。荧光发射光谱的形状与激发波长的选择无关。电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光镜像规则：荧光发射光谱和它的吸收光谱呈镜像对称关系。S0S1基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的零振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁也然。11.2.3分子结构与荧光的关系荧光寿命：当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到最大荧光强度的1/e所需的时间，常用τf表示。1.荧光寿命和荧光效率ft01tttF0tFln作图，斜率即为对时的荧光强度）（时的荧光强度）（以荧光效率(荧光量子产率）：吸收激发光的光子数发射荧光的光子数。～取值在102.有机化合物分子结构与荧光的关系这些条件与分子的结构有关。分子产生荧光必须具备的条件（1）具有强的紫外－可见吸收。（2）具有一定的荧光效率。→*跃迁是产生荧光的主要跃迁类型芳香族化合物及杂环化合物.共轭体系越大,越易产生荧光,荧光效率也增大。─(CH=CH)3─φ=0.68─(CH=CH)2─φ=0.281.长共轭效应2.刚性结构和共平面效应3,4-苯并芘(强荧光物质)联二苯φ=0.2芴φ=1.0CH2NOHNOHMg1/28-羟基喹啉8-羟基喹啉镁（弱荧光物质）（荧光增强）给电子基增强荧光：（p-π共轭）－OH,－OR,－NH2,－NHR,－NR2,－C≡N吸电子基减弱荧光：（妨碍分子的电子共轭性）－COOH,－C=O,－NO2,－N＝N,－Cl,－Br,－I与体系作用小的取代基影响不明显：－SO3R,－NH3＋,－SH,－F,－R3.取代基的作用无荧光荧光强50倍COOHNO2INH2OH比取代基之间若发生氢键，增强分子平面性和刚性会加强荧光：碱性有荧光COOHOH无荧光OHCOOH水杨酸中性、碱性均有荧光OHOHCO11.2.4影响荧光强度的主要外部因素荧光强度对温度变化敏感，温度增加，外转换去活的几率增加。荧光素钠的乙醇溶液,T0℃时,每降低10℃,φ增加3%，-80℃时φ=100%。1.温度同一物质在不同溶剂中，其荧光光谱的形状和强度都有差别。一般情况，荧光波长随溶剂极性的增加而长移，荧光强度也增强。荧光分析中应选择合适的溶剂。2.溶剂的影响有荧光无荧光OHO—3.酸度3NHOHHNH2NHOHHpH2pH13pH=7~12有荧光无荧光无荧光荧光分析中应选择合适的pH范围。4.荧光熄灭的影响又称荧光猝灭，指荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用引起荧光强度降低或荧光强度与浓度偏离线性关系的现象。卤素离子、重金属离子、氧分子及硝基化合物、重氮化合物、羰基和羧基化合物碰撞猝灭；溴、碘、氧的熄灭作用；浓度较高时发生自熄灭现象等。5.散射光的干扰瑞利光和拉曼光光线通过试样，透射仍为主体波长远小于粒径，小部分散射仅改变方向，波长不变。弹性碰撞无能量交换。瑞利散射λ不变拉曼散射λ变波长变长或变短。非弹性碰撞有能量交换。示意图样品池透过光λ不变瑞利散射λ不变拉曼散射λ变λ增大λ减小为避免拉曼光的影响，注意选择合适的激发波长及合适的溶剂。转定量方法见表11-1不同波长激发光下主要溶剂的拉曼光波长浓度：稀溶液，F∝c(bc≤0.05)光源：F∝I0，应强度大，稳定。内滤光作用和自吸现象：其它因素：11.3荧光定量分析方法11.3.1荧光强度与物质浓度的关系由朗伯-比耳定律：I=I0•10-ECLF=K'•I0(1-10-ECL)=K'•I0(1-e-2.3ECL)浓度很低时，将括号项近似处理后：F=2.3K'I0ECL=KC荧光强度F正比于吸收的光量(I0-I)和荧光量子效率：F=K'(I0-I)（EcL0.05）解释：为何荧光分析法的灵敏度比紫外－可见分光光度法的灵敏度高？见P29011.3.2定量分析方法配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度；作图对））（）（）（）（以（空空空空空5432154321CCCCCFFFFFFFFFF1.标准曲线法在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，比较；xsxCCFFFF00s2.比例法11.4荧光分析技术及应用11.4.1荧光分光光度计荧光光度计示意图I0ItF氙灯(或高压汞灯）（200-800nm)光电倍增管荧光仪部件：激发光源:能够在紫外-可见光区连续发光，常用氙灯、高压汞灯或激光光源.样品池:石英池，四壁透明.单色器:两个光栅单色器,分置于样品池前后。检测器:光电池或光电倍增管,与激发光成直角的方向检测荧光.荧光光度计光路图电源光度计记录仪光电倍增管试样液池光源仪器校正1）灵敏度校正最常用的是硫酸奎宁溶液。影响灵敏度的因素众多。即使是同一台仪器在不同时间测定，结果也不尽相同。故而可在每次测定时，在选好的参数条件下（例如波长、狭缝宽度）用一种浓度确定稳定的荧光物质溶液对仪器进行校正。2）激发光谱和荧光光谱的校正理想的荧光分光光度计应具备如下条件：A.激发光源要在各个波长处以同样的光子数发射出来；B.单色器对各种波长光线的透射率应该一样，单色器的效率应与偏振光无关；C.检测器对各种波长的检测效率一样。“表观光谱或未校正光谱”