食品类微生物实验

菌样被无菌水不同稀释倍率后平板培养图实验1显微镜的使用•一、实验目的和内容•目的：学习显微镜低倍镜和高倍镜的使用技术，了解油浸系物镜的基本原理，掌握油浸系物镜的使用方法。•内容：1．学习油浸系物镜的使用方法。•2．用油镜观察枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌染色装片。•二、实验材料和用具•枯草芽孢杆菌（Bacillussubitilis）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）的染色装片。•香柏油、二甲苯、显微镜、擦镜纸。•三显微镜的构造与成像原理•（一）显微镜的构造包括机械部分和光学部分•1．机械部分：镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、移动器、粗调器和细调器。•（1）镜座和镜臂它们是显微镜的基本骨架，起稳固和支持显微镜的作用。•（2）镜筒镜筒上接目镜，下接转换器，形成目镜与物镜（装在转换器下）间的暗室。•（3）物镜转换器物镜转换器上可安装3-4个物镜，可以按需要将其中的任何一个接物镜和镜筒接通，与镜筒上面的接目镜构成一个放大系统。•（4）载物台用于安放玻片。载物台中有一孔，为光线通路。在台上装有弹簧标本夹和推动器，其作用为固定或移动标本的位置，使得镜检对象恰好位于视野中心。•（5）推动器是移动标本的机械装置。•（6）调焦装置即粗螺旋和细螺旋，是移动镜筒调节接物镜和标本间距离的机件。•2．光学部分：目镜、物镜、聚光器、光圈、反光镜。•显微镜的光学系统•（l）反光镜由一平面和另一凹面的镜子组成，可以将投射在它上面的光线反射到聚光器透镜的中央，照明标本。•（2）聚光器在载物台下面，它是由聚光透镜、虹彩光圈和升降螺旋组成的。其作用是将光源经反光镜反射来的光线聚焦于样品上，以得到照明，使物象获得明亮清晰的效果。•（3）物镜•物镜的种类很多，可从不同角度来分类：•根据物镜前透镜与被检物体之间的介质不同，可分为：•①干燥系物镜以空气为介质，如常用的40X以下的物镜，数值孔径均小于1。•②油浸系物镜常以香柏油为介质，此物镜又叫油镜头，其放大率为90X-100X，数值孔径值N.A大于1。•根据物镜放大率的高低，可分为：•①低倍物镜指l0X以下；•②中倍物镜指20X；•③高倍物镜指40X-65X；•④油浸物镜指90X以上。•（4）目镜目镜的作用是把物镜放大了的实像再放大一次，并把物像映入观察者的眼中。普通光学显微镜的目镜通常由两块透镜组成，上端的一块透镜称“接目透镜”，下端的透镜称“聚透镜”。上下透镜之间或在两个透镜的下方，装有由金属制的环状光阑或叫“视场光阑”。•（二）显微镜的成像原理•显微镜的放大是通过透镜来完成的，单透镜成像具有像差，影响像质。由单透镜组合而成的透镜组相当于一个凸透镜，放大作用更好。•显微镜的结构光线在穿过折射率不同的介质时发生折射。•（三）显微镜的性能•显微镜分辨能力的高低决定于光学系统的各种条件。被观察的物体必须放大率高，而且清晰，物体放大后，能否呈现清晰的细微结构，首先取决于物镜的性能，其次为目镜和聚光镜的性能。•油镜头的辨认•油镜头上常刻有OI（oilimmersion）或HI（homogeneneousimmersion）字样，有的还刻有一圈红线或黑线标记，在低倍物镜、高倍物镜和油镜3物镜中，油镜的放大倍数和数值孔径（numericalaperture）最大，而工作距离最短。•四、操作步骤•（一）观察前的准备•1．放置：将显微镜置于平稳实验台上，镜座距实验台边沿约为10cm。坐正，练习用左眼观察。•2．调节光源：将低倍物镜转到工作位置，把光圈完全打开，聚光器升至与载物台相距约1mm左右。转动反光镜采集光源，光线较强的天然光源宜用平面镜，光线较弱的天然光源或人工光源宜用凹面镜，对光至视野内均匀明亮为止。观察染色装片时，光线宜强；观察未染色装片时，光线不宜太强。•（二）低倍镜观察染色装片•首先上升镜筒，将枯草芽孢杆菌染色装片置于载物台上，用标本夹夹住，将观察位置移至物镜正下方，物镜降至距装片0.5cm处，适当缩小光圈然后两眼从目镜观察，转动粗调节器使物镜逐渐上升（或使镜台下降）至发现物像时，改用细调节器调节到物像清楚为止。移动装片，把合适的观察部位移至视野中心。•（三）高倍镜观察•眼睛离开目镜从侧面观察，旋转转换器，将高倍镜转至正下方，注意避免镜头与玻片相撞。再由目镜观察，仔细调节光圈，使光线的明亮度适宜。用细调节器校正焦距使物镜清晰为止。将最适宜观察部位移至视野中心，绘图。不要移动装片位置，准备用油镜观察。•（四）油镜观察•1．提起镜筒约2cm，将油镜转至正下方。在玻片标本的镜检部位（镜头的正下方）滴一滴香柏油。•2．从侧面注视，小心慢慢降下镜筒，使油镜浸在油中至油圈不扩大为止，镜头几乎与装片接触，但不可压及装片，以免压碎玻片，损坏镜头。•3．将光线调亮，左眼从目镜观察，用粗调节器将镜筒徐徐上升（切忌反方向旋转），当视野中有物像出现时，再用细调节器校正焦距。如因镜头下降未到位或镜头上升太快末找到物像，必须再从侧面观察，将油镜降下，重复操作直至物像看清为止。仔细观察并绘图。•4．再次观察提起镜筒，换上金黄色葡萄球菌染色装片，依次用低倍镜、高倍镜和油镜观察，绘图。重复观察时可比第一次少加香柏油。•（五）镜检完毕后的工作•1．移开物镜镜头。•2．取出装片。•3．清洁油镜，油镜使用完毕后，须用擦镜纸擦去镜头上的香柏油，再用擦镜纸沾少许二甲苯擦掉残留的香柏油，最后再用干净的擦镜纸擦干残留的二甲苯。•4．擦净显微镜，将各部分还原。将接物镜呈“八”字形降下，不可使其正对聚光器，同时降下聚光器，转动反光镜使其镜面垂直于镜座。最后套上镜罩，对号放入镜箱中，置阴凉干燥处存放。•四、注意事项•1．使用油镜必须按先用低倍镜和高倍镜观察，再用油镜观察•2．下降镜头时，一定要从侧面注视，切忌用眼睛对着目镜，边观察边下降镜头的错误操作，以免压碎玻片而损坏镜头。•3．使用二甲苯擦镜头时，注意二甲苯不能过多，以防溶解固定透镜的树脂。•4．注意保持显微镜的洁净，对金属部分要用软布擦拭，擦镜头必须用擦镜纸，切勿用手或用普通布、纸等，以免损坏镜头。实验2细菌的染色与观察•一目的要求•1．了解简单染色法和革兰氏染色法的基本原理，熟练掌握细菌的涂片与革兰氏染色技术。•2．初步学习细菌细胞特殊结构的染色方法，并观察细菌的特殊结构。•3．观察细菌的菌落平板，学会识别大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色葡萄球菌的菌落特征。学会初步鉴别微生物的种类的方法。•二实验内容与原理•1．简单染色法原理•简单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法，一般用于观察个体形态与细菌排列。由于细菌在中性、碱性或弱酸性环境中带负电荷，所以通常采用一种碱性染料如美蓝、碱性复红、结晶紫对细菌进行染色。美蓝是美蓝的盐酸盐，可解离为带正电荷的美蓝，很容易与细菌结合使菌体着色。染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。•简单染色过程：涂片→固定→染色→水洗→干燥→镜检•2．革兰氏染色法原理•革兰氏染色法是由丹麦医生HansChristianGram于1884年创立。它是细菌学中很重要的鉴别染色法，因为通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G－）两大类。•革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁结构的比较•革兰氏染色过程：涂片→固定→结晶紫初染（1min）→碘液媒染（1min）→乙醇脱色（95%酒精，30s）→番红复染（30秒）→干燥→镜检•阳性菌：紫色阴性菌：红色•革兰氏染色要点：•1）初染：用结晶紫，染色1分钟，水洗。•2）媒染：加碘液覆盖1分钟后水洗。•3）脱色：连续滴加95％乙醇，约30秒，直到滴下的乙醇无色为止，水洗。（关键）•4）复染：加番红染色1分钟，水洗。•5）干燥。•6）镜检：先低倍镜，后油镜观察。•注意：涂片要薄而均匀，脱色程度要控制得当。•3．芽孢染色原理•细菌的芽孢壁比营养细胞壁厚，致密，透性差，着色和脱色都比营养细胞困难，故一般采用一种碱性染料并在微火上加热，或延长染色时间，使菌体和芽孢都染上颜色以后水洗或稀酸冲去菌体的染料，芽孢仍保留颜色，再用另一种对比鲜明的染料使菌体着色，如此可明显区分芽孢和营养体结构。•操作方法：•1）用枯草杆菌涂片、干燥、固定。•2）在涂菌处滴加5％的孔雀绿染液，用木夹夹住玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但不沸腾5－6分钟。加热时应添加染料，以免蒸干。水洗。•3）0.5％番红复染1分钟，水洗，烘干，镜检（芽孢绿色，菌体红色）。•4．荚膜染色原理•荚膜与染料亲和力低。在用简单染色法时，可以辨认出来。而通过荚膜染色也可以把它和细胞区别开来。•操作方法：•1）涂片，晾干。•2）用Tyier氏醋酸结晶紫溶液染色2分钟，再用20%硫酸铜溶液洗涤，水洗，用滤纸吸干、干燥。•3）镜检：荚膜染成浅红色，细胞呈紫红色。•5．鞭毛染色法原理•细菌鞭毛直径为10-12nm，超过了光学显微镜的分辨能力。所以染色时，不仅要使鞭毛染色，还要使一部分染料堆积在鞭毛上，加粗鞭毛的直径以便能观察。鞭毛染色的方法很多，但染色成功的关键一是必须使用新鲜培养、活动活泼的菌体进行染色；二是使用绝对无油的干净玻片，以便菌液流过玻片时能保持自然形态。细菌的运动性，可通过悬滴法制片观察。注意区分布朗运动和细菌本身的运动。•操作方法：•1）载片的制备：经过严格清洗后，置于95%乙醇中浸泡，用时才取出，用火焰烧去酒精，立即使用。•2）菌种的制备：取已活化3-5代的变形杆菌（或枯草杆菌）接种于新制备的肉汤琼脂斜面，斜面下部最好有冷凝水，培养8-9h即可使用。•3）制片：在载玻片的一端滴一滴蒸馏水，挑取少许菌苔底部有水部分的菌体，将接种环悬放在水滴中片刻，再将载片稍倾斜，使菌液随水滴缓慢流到另一端，放平，晾干。•4）染色：滴加鞭毛染色液A，3-5分钟，小心水洗干净，然后滴加鞭毛染色液B，30-60秒，水洗，晾干。•A液：a.5%石炭酸10mlb.鞣酸2gc.饱和硫酸钾铝10mlB液：结晶紫酒精饱和溶液。应用液：A液10份，B液1份，混合过滤后室温存放。试剂配制说明：A液：又称媒染剂，其中的石炭酸又名苯酚，配制5%石炭酸：将5g石炭酸溶于100ml蒸馏水中，加温有助于试剂溶解。鞣酸又名单宁酸，具有沉淀蛋白质的作用，在媒染过程中起到重要作用。配制饱和硫酸钾铝：将25g明矾溶于100ml蒸馏水中，加温有助于明矾的溶解。a、b、c三种试剂混合后需加温，有助于其中的鞣酸溶解。B液：又称染色剂，饱和结晶紫酒精溶液的配制：12g结晶紫溶于100ml无水乙醇中。应用液的A液和B液混合后需加热溶解，因鞣酸为胶状物，常温下不易溶解。A染液和B染液混合后需用0.2M的滤膜或较厚的过滤纸过滤，放置1～2天后染色的效果较好。•5）镜检：菌体、鞭毛均为褐色。•悬滴法：•1）在盖玻片上滴小半滴无菌水。•2）以无菌操作挑菌，接种环在水上轻点几下。•3）将盖玻片迅速翻转置于凹玻片上即可观察。•6.菌落特征的观察•注意细菌落形状、大小、颜色、光泽、透明度、干燥或湿润、粘稠度、隆起情况、边缘状况等。实验3酵母菌的形态观察•一目的要求•1.观察酵母菌的个体形态及出芽生殖方式，学习区分酵母菌死活细胞的实验方法。•2.掌握酵母菌的菌落特征及其与细菌菌落的区别。•二实验原理•酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，多数是圆形或椭圆形，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍。用美蓝对酵母菌的活细胞进行染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，因此，具有还原能力的酵母活细胞是无色的、而死细胞或代谢作用微弱的衰老细胞则呈蓝色或淡蓝色，借此即可对酵母菌的死细胞和活细胞进行鉴别。•三实验材料•（1）菌种：啤酒酵母、面包酵母、裂殖酵母、热带假丝酵母。•（2）0.1%的美蓝染色液，芽孢染色液、无菌水、盖玻片、载玻片。•四内容与步骤•1．菌落特征和菌苔特征的观察。观察菌落表面干燥或湿润、隆起形状、边缘整齐度、大小、颜色等，并用接种环挑菌，注意与培养基结合是否紧密。取斜面培养的啤酒酵母、面包酵母、热带假丝酵母观察菌苔特征。•2．个体形态与出芽生殖：采用水