病原生物学与免疫学实验

病原生物学与免疫学实验病原生物学与免疫学教研室2004年2月病原生物学与免疫学实验室规则微生物学实验室是进行微生物培养鉴定及试验的场所，是一个微生物高度集中的区域，为了防止微生物感染人体及扩散，保证安全及每次实验结果的准确性，要求同学遵守下列规则：一般注意事项进实验室穿上实习衣，离室时脱下，要反折，并经常进清洗。书包、衣物等勿带入实验室，必要的文具、实验指导，笔记等带入后，也要远离操作部位。实验室内要保持安静，有秩序，不得高声谈笑，或随便走动以免影响他人实验。实验室内禁止饮食、吸烟和用嘴湿润铅笔或标签等，也不要以手抚摸头部等部位。做练习要保持无菌操作操作。以防止临床标本及纯培养物的污染，吸过菌液的吸管、毛细吸管，要投入含有2～3％来苏儿或0.1％新洁而灭液的玻璃筒中，其它带菌材料放在指定地点，以防止微生物污染环境。若发生吸入菌液，割破手指等事故，应立即报告老师，进行预防处理。爱护公物，节约使用实验材料、器材，如损坏公物，应立即向指导教师报告，登记处理。实验完毕，应及时清理实验室，做好卫生，关好门、窗、水笼头、电灯。离开实验室前，应在消毒液中将手浸泡5～10分钟，再用清水洗净。发生意外事故的处理皮肤破伤：用生理盐水洗净后，涂以2％红汞或2％碘酒。烧伤：涂以凡士林油，5％鞣酸或2％苦味酸。化学药品腐蚀伤：若为强酸，先用大量清水冲洗，再以5％碳酸氢钠或5％氢氧化铵溶液中和之；强碱腐蚀则先以大量清水冲洗后，再以5％醋酸或5％硼酸洗涤中和。吸入病原菌菌液：应立即吐人容器内消毒，并用1∶1000高锰酸钾溶液或3％双氧水漱口。菌液流洒桌面，倾倒适量消毒液于污染面浸泡半小时后抹去，再以清水擦洗干净。严防火灾：试验完毕立即关闭电闸，煤气阀门，如系酒精，乙醚、汽油等火种，切忌用水，可撒泼大量沙土等扑灭火苗。实验一细菌的形态学第一周实验内容普通光学显微镜的使用细菌基本形态和特殊结构的观察细菌标本染色检查法（革兰氏染色法）细菌动力检查法（悬滴法、压滴法）目的要求了解细菌的基本形态及其特殊结构。基本掌握显微镜的使用和保养。掌握接种环的使用及菌液的采取法。掌握细菌涂片的制备及革兰氏染色方法。熟悉细菌动力检查法。一、普通光学显微镜的使用显微镜的构造图显微镜的使用方法油镜头的辨认显微镜的维护油镜加香柏油的原理玻璃折射率：n=1.52香柏油折射率：n=1.515二、细菌基本形态和特殊结构的观察使用显微镜的油镜观察各示教片，比较各菌的形态、大小、排列等；注意芽胞在菌体上的位置、大小；鞭毛形态、数最及其位置；荚膜的大小及其与菌体的关系，将观察结果画在实验报告上。1.细菌的三种基本形态（示教）球菌：链球菌、葡萄球菌。杆菌：大肠杆菌。螺形菌：霍乱弧菌。上述示教镜各一台/每室细菌的三种基本形态示意图⊕葡萄球菌：Figure1-AGramstainofGram+Staphylococcuscells.链球菌链球菌（显微镜下示意图）显微镜下的杆菌杆菌(bacillus)Figure2-GramstainofGram-E.colicells弧菌2.细菌的特殊结构观察（示教）芽胞示教片：破伤风杆菌。鞭毛示教片：变形杆菌。荚膜示教片：肺炎双球菌。上述示教镜各一台/每室芽孢产芽孢细菌的种类菌体（营养细胞）芽胞鞭毛荚膜的观察：特殊染色负染色三、细菌标本染色检查法常采用美蓝，结晶紫等碱性染料进行染色。多数染料都是中性有机盐。据着色基的不同可分为以下类型：碱性染料（basicdye）—带正电染料。其阳离子部分为发色基团，可与细胞中带负电的组分结合。酸性染料（Aciddye）—带负电染料。其阴离子部分为发色基团，可与细胞中带正电的组分结合。活菌染色简单染色法抗酸染色革兰氏染色复杂染色法普通染色芽孢染色法荚膜染色法细胞壁染色法特殊染色正染色负染色死菌染色细菌染色细菌染色法:负染色染色1min水洗、吸干镜检简单染色制备涂片标本→染色（一）细菌涂片的制备一般制备涂片包括涂片、干燥、固定三步。涂片干燥固定固定的目的：使细菌的细胞凝固，使菌体与玻片粘得更牢固；可改变菌体对染料的通透性；加热固定可杀死细菌，比较安全。多种标本涂片标记示意图如多种标本，可用蜡笔在玻片上划为数格，并于玻片的背面，标明标本的编号。正面反面㈡革兰氏染色法（GramStain）初染：滴加结晶紫染液于涂片上，染1分钟，水洗，甩干。媒染：加卢戈氏碘液，1分钟后水洗，甩干。脱色：加95％酒精数滴于涂片上，频频摇3～5秒后，斜持玻片，使酒精流去，再加酒精。如此重复2～3次，直至流下的酒精无色或稍呈淡紫色时为止（约30秒钟）。水洗，甩干。复染：以稀释石炭酸复红染液复染1分钟后，水洗，待干或用吸水纸印干，油镜镜检。【操作步骤】结晶紫初染碘液媒染乙醇脱色复红复染涂片固定由丹麦医生HansChristianGram于1884年创立。革兰氏染色法【结果】细菌被染成紫色者，称为革兰氏阳性菌；而细菌染成红色者，称为革兰氏阴性菌；阳性菌——紫色阴性菌——红色【意义】鉴别细菌，用本法染色可将细菌分成两大类。了解致病性指导选择用药【革兰氏染色法的原理】有三种学说。1.等电点学说：革兰氏阳性细菌的等电点（pH2～3）比阴性菌（pH4～5）为低，—般染色时溶液的酸碱度约在pH7左右，电离后阳性菌带有的阴电荷比阴性菌多。因此，摄取的碱性染料亦较多，不易脱色。2.通透性学说：革兰氏阳性菌细胞膜的通透性比阴性菌低，进入细胞的染料和碘液结合生成沉淀，脱色剂较易通过革兰氏阴性菌的细胞膜，将碘和染料的复合物溶解洗出，故易脱色；阳性菌细胞膜透通性低，故不易脱色。甲菌乙菌初染结晶紫媒染碘液脱色乙醇复染沙黄紫色（G＋）红色（G-）革兰氏染色步骤示意图细胞壁与革兰氏染色3.化学学说：革兰氏阳性菌细胞内含有某种特殊化学成份，一般认为是核糖核酸镁盐与多糖的复合物，它能和料染一煤染剂复合物相互结合，使已着色的细菌不易脱色。四、细菌动力检查法鞭毛是细菌的运动器官，有鞭毛的细菌，具有运动的能力，能定向地由一个部位泳动到另一个部位。许多杆菌和螺菌或弧菌具有鞭毛，细菌的运动力是细菌特征之一，所以检查细菌的动力可以鉴别细菌。检查细菌动力的方法悬滴法、压滴法、暗视野显微镜法、半固体琼脂培养法等。1.悬滴法（示教）【材料】菌种：变形杆菌、葡萄球菌的幼龄（8-12小时）肉汤培养液。凹玻片、盖玻片、凡士林。【方法】悬滴法见图1-62.压滴法【材料】菌种：变形杆菌、葡萄球菌的幼龄（8-12小时）肉汤培养液。盖玻片、载玻片、镊子。【方法】五、示教操作细菌涂片的制备革兰氏染色法的步骤接种环、接种针的使用（图1-4）菌液采取法接种环（上）和接种针（下）柄约22cm2—5mm绝缘柄约7.5cm金属柄约14.5cm5—8cm安装环(针)的螺口(约8mm)菌液采取法图1-5无菌操作技术