4第四章外植体的接种和培养

第四章外植体的接种和培养第一节外植体的接种第二节培养方法第三节培养条件第四节外植体的褐变及其预防措施第五节试管植物的玻璃化现象及其预防措施1接种室的消毒无菌操作室的地面、墙壁和工作台的灭菌可用2%的新洁尔敏或70%的酒精擦洗，然后用紫外灯照射约20min。使用前用70%酒精喷雾，使空间灰尘落下。一年中要定期一、二次用甲醛和高锰酸钾熏蒸。第一节外植体的接种2外植体的接种接种：是把经过表面消毒后的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，并将它们转放到无菌培养基上的全部操作过程。D关紫外灯，开日光灯及风机，擦双手及台面E擦拭接种工具并反复灼烧，烘烤培养皿F接种完，清理台面并标识B接种前20min打开紫外灯C接种员洗手，在缓冲间换鞋、穿好实验服A接种前4h接种室灭菌无菌操作第四章外植体的接种和培养第一节外植体的接种第二节培养方法第三节培养条件第四节外植体的褐变及其预防措施第五节试管植物的玻璃化现象及其预防措施第二节培养方法1固体培养优点:简单，应用广泛，一般只要有培养室及接种箱即可开展工作。缺点:外植体或愈伤组织只有底部表面接触培养基，吸收养分，造成各部分营养浓度差异，影响生长。外植体插入培养基后，气体交换不畅及排泄物质积累，影响组织吸收和造成毒害。受光不均匀，生长不一致。2．液体培养分静止培养和振荡培养：2.1静止液体培养优点：培养基中不出现营养物浓度差异的现象，可以用来进行许多营养方面的研究工作。静止培养不需增添专门设备，适合于某些原生质体培养；2.2振荡液体培养(1)连续浸没搅动或振动培养液使组织悬浮于培养基中。培养液的体积约占容器体积的20％，以确保最大的气相表面，造成较好的通气条件。大多培养采用摇床：往复式摇床和旋转式摇床都可用，但以用后者为多。振动速度一般是50-100转／分。(2)定期浸没组织块时而在液体中时而在气体里，这样既可保证培养基的充分混和，又保证了组织块呼吸所需的气体交换。转床第四章外植体的接种和培养第一节外植体的接种第二节培养方法第三节培养条件第四节外植体的褐变及其预防措施第五节试管植物的玻璃化现象及其预防措施第三节外植体的培养条件培养条件包括：光照、温度、湿度、氧气和培养基的pH值等。1）25±2ºC。2）植株种类及外植体的不同，其最适温度也是不同的。如百合20℃；月季25-27℃；番茄28℃。低于15C或高于35C，对生长都是不利的。△1温度2光照1）光强★影响外植体细胞的增殖、组织和器官的分化。★有的材料愈伤组织的诱导需光或需暗；★普通培养室要求光照强度1000lx-5000lx。★光照强，幼苗生长健壮；光照弱，幼苗生长弱小，容易徒长。★不同波长的光对细胞的分裂和器官的分化有影响。2）光质②白光促进小花天竺葵愈伤组织的生长，蓝光则无作用。如：①红光促进杨树愈伤组织的生长，蓝光阻碍其生长。3）光照时间根据植物生物学特性决定；每日光照12h-16h，1)pH值5-6.5，一般为5.8，调整用1M的NaOH和HCl溶液。3pH值2)pH影响培养基的硬度。pH＞6.0培养基会变硬；pH＜5.0培养基不易凝固。3)灭菌之前，培养基的pH要比标准提高0.2－0.3个单位。4湿度1）瓶内的湿度：主要受到培养基含水量和封口膜透性的影响。如培养基过硬，则不利于外植体接触和插入培养基，导致生长迟缓；封口膜过于透气，也会使瓶内湿度下降。2）环境湿度：过低会使培养基丧失大量水分，渗透势升高，影响材料对营养物质的吸收，也会阻碍外植体的生长。一般为70－80%。5气体(必要条件)1）培养瓶内氧气的充足与否与封口材料有关。•可用棉塞或特制的封口塑料。•通气最好的是棉塞，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。2）培养基内氧气充足与否与培养基的种类和培养方式有关。◆固体培养基可加进活性炭来增加通气度,以利于发根。◆液体培养时，采取振荡培养，增加通气性。第四章外植体的接种和培养第一节外植体的接种第二节培养方法第三节培养条件第四节外植体的褐变及其预防措施第五节试管植物的玻璃化现象及其预防措施第四节外植体的褐变及其防止褐变：是指外植体在培养过程，自身组织从表面向培养基释放出褐色物质，以致培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。1褐变的原因2影响褐变的因素3褐变的预防措施1褐变的原因褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物和多酚氧化酶有关。通常酚类化合物和多酚氧化酶分隔存在，比较稳定。当切割外植体后，切口附近的分隔作用破坏，酚类与多酚氧酶接触，在多酚氧化酶的催化下酚类迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致组织代谢紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。2影响褐变的因素2.1．植物材料2.2．培养条件2.3．培养基2.4．材料转瓶周期2.1植物材料（1）基因型不同种植物，同种植物不同类型、不同品种在组织培养中褐变发生的频率、严重程度都存在很大差别。木本植物一般比草本植物容易发生褐变。木本植物木质素、单宁含量或色素含量高。而酚类的糖苷化合物是木质素、单宁和色素的合成前体。（2）材料年龄幼龄材料一般都有比成龄材料褐变轻的趋势。幼龄材料褐变较轻与其酚类化合物含量少有关。（3）取材部位分生部位接种后醌类物质形成少；而分化部位接种后醌类物质形成多。（4）取材时期多酚氧化酶活性和酚类含量基本对应，春季较弱，随着生长季节的到来，酶活性逐渐增强。茎尖太小很容易发生褐变。取外植体时还要考虑其粗度，细的可切短些，粗的可切得长些。（5）外植体大小及受伤害程度2影响褐变的因素2.1．植物材料2.2．培养条件2.3．培养基2.4．材料转瓶周期光照与温度。温度过高或光照过强，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速外植体的褐变。2.2．培养条件（1）培养基状态液体培养基可有效克服外植体褐变。在液体培养基中，外植体溢出的有毒物质可以很快扩散，因而对外植体造成的伤害较轻。2.3培养基在初代培养时，培养基中无机盐浓度过高，酚类物质将会大量外溢，导致外植体褐变。原因：无机盐中的有些离子，如Mn2+、Cu2+是参与酚类合成与氧化酶类的组成成分或辅因子。（2）无机盐（3）植物生长调节物质黑暗条件下，生长调节物质的存在会影响褐变，此时去除生长调节物质可减轻褐变。细胞分裂素6-BA或KT不仅能促进酚类化合物的合成，而且还能刺激多酚氧化酶的活性。生长素类如2，4-D和IAA可延缓酚类化合物的合成，减轻褐变现象发生。（4）抗氧化剂抗氧化剂可改变外植体周围氧化还原电势，从而抑制酚类氧化，减轻褐变。常用抗氧化剂：半胱氨酸、VC、硫代硫酸钠等。（5）吸附剂活性碳和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为吸附剂可以去除酚类氧化造成的毒害效应，（6）pH值培养基的pH值较低时，可降低多酚氧化酶活性和底物利用率，从而抑制褐变。而pH值升高则明显加重褐变。2影响褐变的因素2.1．植物材料2.2．培养条件2.3．培养基2.4．材料转瓶周期2.4．材料转瓶周期对于易褐变的材料，接种后转瓶时间长，伤口周围积累醌类物质增多，褐变加重，以致全部死亡。缩短转瓶周期可减轻褐变。1褐变的原因2影响褐变的因素3褐变的预防措施3褐变的预防措施3.1．选择适宜的外植体外植体应选择分生能力较强的材料。如采用实生苗茎尖、枝条顶芽、幼胚等材料培养褐变程度比较轻。3.2．采用适宜的培养基和光温条件培养基的无机盐成分、蔗糖浓度、激素水平、温度适宜及在黑暗条件下培养，或在取外植体之前对母株进行遮光处理20d～40d，可以显著减轻材料的褐变。3.3．培养基中加活性炭、抗氧化剂和其他抑制剂0.1%～0.5%的活性炭对吸附酚类氧化物的效果很明显。加抗坏血酸、血清白蛋白、有机酸、蛋白质、蛋白质水解产物、氨基酸、硫脲、二氨基二硫代甲酸钠、亚硫酸氢钠、氰化钾、苏糖二硫醇等抗氧化剂和其他抑制剂，或用它们进行材料的预处理或预培养，可有效地预防醌类物质的形成。3.4缩短转瓶周期对容易褐变的材料可间隔12～24小时培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7～10天后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。第四章外植体的接种和培养第一节外植体的接种第二节培养方法第三节培养条件第四节外植体的褐变及其预防措施第五节试管植物的玻璃化现象及其预防措施第五节试管植物的玻璃化现象及其预防措施1外植体的玻璃化2玻璃化苗的危害性3玻璃化的原因4玻璃苗发生的机理5预防玻璃化的措施1外植体的玻璃化（vitrification）是指组培苗出现叶、嫩梢呈水晶透明或半透明，植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表皮缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具有栅栏组织，仅有海绵组织；体内含水量高，但干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素含量低的现象。2玻璃化苗的危害性由于其组织畸形，吸收养料与光合器官功能不全，分化能力大大降低，因而很难继续用作继代培养和扩大繁殖的材料；加上生根困难，很难移栽成活。第五节试管植物的玻璃化现象及其预防措施1外植体的玻璃化2玻璃化苗的危害性3玻璃化的原因4玻璃苗发生的机理5预防玻璃化的措施3玻璃化的原因玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化。产生因素：主要有激素浓度、琼脂用量、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。3.1激素浓度激素浓度增加尤其是细胞分裂素浓度提高（或细胞分裂素与生长素比例高），易导致玻璃化苗的产生。3.2琼脂浓度培养基中琼脂浓度低时玻璃化苗比例增加，水浸状严重，苗向上长。随着琼脂浓度的增加，玻璃化苗比例减少，但硬化的培养基影响了养分的吸收，试管苗生长减慢，分蘖亦减少。琼脂浓度一定要适当。3.3温度适宜的温度可以使试管苗生长良好当温度低时，容易形成玻璃化苗，温度越低玻璃化苗的比例越高。温度高时玻璃化苗减少，且发生的时间较晚。3.4光照时间不同的植物对光照的要求不同，满足植物的光照时间，试管苗才能生长正常。大多数植物在10h～12h光照下都能生长良好，光照时数大于15h时，玻璃化苗的比例明显增加。3.5通风条件试管苗生长期间，要求有足够的气体交换，气体交换的好坏取决于生长量、瓶内空间、培养时间和瓶盖种类。在一定容量的培养瓶内，愈伤组织和试管苗生长越快，越容易形成玻璃化苗。如果培养瓶容量小，气体交换不良，易发生玻璃化。3.6离子水平植物生长需要一定的矿物质营养；但如果营养离子之间失去平衡，试管苗生长就会受到影响。植物种类不同，对矿物质的量、离子形态、离子间的比例要求不同。如果培养基中离子种类及其比例不适宜该种植物，玻璃化苗的比例就会增加。第五节试管植物的玻璃化现象及其预防措施1外植体的玻璃化2玻璃化苗的危害性3玻璃化的原因4玻璃苗发生的机理5预防玻璃化的措施4玻璃苗发生的机理4.1乙烯的作用Kevers等、张洪胜等认为在试管苗玻璃化过程中，作为内源激素的乙烯从代谢调节上起关键性启动作用。乙烯的产生则取决于培养环境中的胁迫条件，如水势不当，通气不畅（造成缺氧）及培养基用BA量过高等，均会导致乙烯产生。乙烯产生后引发了其他激素质和量上的改变及酶类的变化。发生蛋白质、纤维素和木质素的合成障碍及降解，叶绿素分解黄化，逐渐形成玻璃化症状；4.2植物光呼吸途径和磷酸戊糖途径与玻璃苗的产生密封瓶口、高温、高浓度细胞分裂素等因子加快了生长速度，加剧了瓶中气体组成的改变。磷酸戊糖途径的中间步骤与戊糖化合物代谢有关（如核酸合成），也与木质素形成有关。当磷酸戊糖途径被抑制时，壁的再生受抑制，戊糖化合物减少，核酸、蛋白质合成受阻。当光呼吸途径被抑制时，减弱了光呼吸对光合的保护作用，过剩的同化物损坏了光合细胞器，不仅降低了光合作用，同时也阻碍了乙醇酸的转化，加重了乙醇酸对植物的毒害作用，从而导致玻璃化的产生。第五节试管植物的玻璃化现象及其预防措施1外植体的玻璃化2玻璃化苗的危害性3玻璃化的原因4玻璃苗发生的机理5预防玻璃化的措施5预防玻璃化的措施5.1适当