ChoosingtheRightToolfortheJob

ChoosingtheRightToolfortheJob:RNAi,TALEN,orCRISPR选择一个恰当的方式：RNAi，TALEN,CRISPR摘要：研究基因功能最常见的方法是减少或阻断基因的正常表达。十多年来，RNAi一直是这一领域的王者，它提供了一个奇妙的方法来阻断许多生物的基因的表达。然而随着新技术的涌现（尤其是CRISPR技术），正逐渐瓦解RNAi在哺乳动物细胞研究中的统治地位。日新月异的技术发展也给研究者们带来了一个问题，“到底应该在实验中选择那一种技术呢？”这篇文章就是通过比较和对比这些技术而形成的一篇指导性文章。引言：人类基因组计划测序的成功(Landeretal.,2001)，给人们提供了关于人类的基本内在作用方式的全新的深入了解，也使得人们向治愈大多数疾病迈进了一大步。在其完成了的15年多后，生物学家仍在继续致力于把攻坚于大量的基因组序列编码的成千上万的未知功能的基因(Birneyetal.,2007)。基因组测序是一个惊人的挑战，但是，具有广大的前景，而且只是最初的一小步。最困难的挑战摆在面前：破译3.3亿DNA碱基对隐藏的意义，通过设定成千上万的基因的功能来说明它们是怎样一起作用使我们之所以成为人类的。这是一个伟大的生物学承诺，但还尚未实现，随着最近新的生物学技术的发展，最大的发现还在后面。破译基因功能的金标准就是阻断正常的基因表达和研究其产生的表型。这种功能失活实验从ThomasMorgan发现了基因位于染色体上而且携带导致变异表型的突变基因开始，已经运用了100多年，在此基础上，数代科学家们致力于用基因突变、化学物质、放射线和病毒整合来映射每一个表型到相应的特异突变基因。这种正向遗传学方法已经被运用了数十年，由于技术上充满了许多挑战（技术上的限制），使得这个过程（试图随机映射和在基因组DNA海洋里的表面上微小病变都）复杂化了。人类基因组的测序提供了一张图，通过这张图，基因的功能可以被破译，但是它缺少方法来有选择地阻断特异基因以非随机的方式。RNAi是被FireandMello发现的，它提供了靶向作用一个基因的神奇的突破口，使得研究者（通过反向遗传学）了解了DNA序列。这项发现的时间是最好不过的了，而且在人类基因组序列可以免费获取之后，它作为一种方法很快就发表了。FireandMello的工作震惊了科学界，他们展示了一个双链RNA简单的注射进入C.线虫（秀丽新小杆线虫），可以强有力地沉默任一基因序列而且产生相应的表型来揭示基因的功能(Fireetal.,1998)。当RNAi的作用机制被发表以后，它很快就被应用到人类细胞中来抑制特异的基因(Elbashiretal.,2001)。它使用的便易使得RNAi这种方法成为了人们破译基因功能的一个选择。然而，RNAi也会产生亚等位基因表型，这种表型并不能反映完全的基因失活，这可能出现在基因突变中。这个和其他实验鼓励了科学家对于反向遗传学的新的技术的探索。随着锌指核酸酶（ZFNs）和随后的转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）的发现(Gajetal.,2013)，功能完全失活的反向遗传学方式变成了可能。这种方法利用定制DNA结合结构域（DBDs），（DBDs被设计用来识别特异的靶向DNA序列），和核酸酶融合，DBDs可以用来引入DNA双链断裂（DSBs）和序列框移突变到基因中，这可以导致它们的敲除(Sungetal.,2013)。一个最新的和难以置信的强有力的新增的基因组编辑方法就是CRISPR/Cas系统。它涉及了细菌对抗病毒感染（传染）（是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御），最初是在嗜热链球菌中被提及的(Barrangouetal.,2007)。最近，从化脓链球菌中提取的II型CRISPR/Cas9系统已经被广泛应用于CRISPR系统中而且成功编辑了人类基因组(Choetal.,2013;Congetal.,2013;Jineketal.,2013;Malietal.,2013c)。CRISPR/Cas系统的整个发现和发展的历程在以前已经得到了极好的描述(DoudnaandCharpentier,2014)。总而言之，这些有力的方法为迅速有效地破译基因的功能提供了一个新的可能。随着不断增加的关于基因失活实验的分子方法的发现，许多研究者就出现了关于选择一个最佳方法的问题。本篇综述就是基于通过比较和对比这些奇异的新的方法的总结（表一Table1），而且给研究者提供了一个“实验指导”来决定怎样来揭示细胞中的基因的功能。你应该选择哪一个呢？正文：RNAiRNAi是一种目前运用于反向遗传学最广泛的方法，用以研究哺乳动物细胞中的基因的功能。它的成功可以归因于进化上保守的内源性信号通路，这个信号通路通过小RNAs调节基因表达(WilsonandDoudna,2013)。内源性的RNAi可以通过引入合成的小RNA进入细胞得以调控，常使用小干扰RNA(siRNA)或小的发夹RNAs（shRNAs）(Mohretal.,2014)。这些方法所产生的结果是一样的，所以引入的RNA结合到RNA诱导的沉默复合体（RISC）上，这个复合体进而促进完全互补的靶向mRNA的降解（图1A）(CarthewandSontheimer,2009)。使用这一方法，可以减少转录后的靶向mRNA和其后的靶向蛋白质水平。然而，由于RNAi的活性形式通常是在细胞质，细胞核中的转录--例如长链非编码RNA（IncRNAs）--就可能很难得以靶向作用(Derrienetal.,2012;FaticaandBozzoni,2014)。此外，最近的研究显示IncRNA本身的转录就可以产生有功能的结果(Kornienkoetal.,2013)。因此，通过RNAi减少IncRNAs的转录后水平可能并不能揭露出他们完全基因失活的表型(Bassettetal.,2014)。RNAi的一个主要的优势在于沉默机制广泛存在于哺乳动物的体细胞中。因此，靶细胞系中没有一个优先的遗传处理是必须的，而且一个单一的siRNA转染会导致一个功能失活的表型。SpecificityandOff-TargetEffectsofRNAi（RNAi的特异性和脱靶效应）（脱靶效应：RNA干扰过程中，siRNA和mRNA特异结合能够使得靶基因沉默。但研究证实，siRNA可能与非靶基因结合而导致非靶基因沉默，这种现象称为siRNA脱靶效应。）自从RNAi被发现以来，在使用RNAi作为研究基因功能一种方法时，人们也越来越关注脱靶效应。已经有发现siRNAs可以通过有限的序列互补性诱导非靶向mRNAs的沉默，这主要是因为通过与3’UTR（3’非编码区）相互作用(CarthewandSontheimer,2009)。当3’UTR的短链区域存在与小RNA存在不完全配对时，这种相互作用就会出现，并引发转录抑制和/或降解(Jacksonetal.,2006;SigoillotandKing,2011)。通过这种基于序列的方式，一个siRNA可能可以抑制成百上千的转录子(SigoillotandKing,2011)。这些脱靶效应似乎是与剂量有关(Wangetal.,2009)，而且来源于它们的表型相较于预期的正确的表型占优势(Franceschinietal.,2014)。除了序列特异性脱靶效应之外，siRNAs和shRNAs人为引入到靶细胞系中也可以引起非系列特异的脱靶效应。正如前面所说的，RNAi通过天然的信号转导通路来调节细胞的基因表达水平，这些信号转导通路系统是由内源性microRNAs调控的。通过外源序列来flooding可以取代RISC中的microRNAs，就可以破坏内源的microRNA的功能，引起基因水平的改变和脱靶效应表型的出现(Khanetal.,2009)。（flooding是指从任何节点发送信息给与之相连的所有其他节点。）正是这些发现推动了人们致力于开发可替换的反向遗传学方法。TranscriptionActivator-LikeEffector（转录激活样效应器）随着可编辑的DNA结合蛋白质--转录激活样效应器（TALEs）的发展，一个从根本上不同的调节基因功能的方法成为了可能。这个方法利用了合成的转录因子DBDs（DBDs识别特异的DNA模体）。TALEDBDs包含有7-34个高度同源的直接重复序列，每一个重复序列由33-35个氨基酸组成。其特异性的关键在于每一个重复序列的12位和13位的2个氨基酸残基，被称为重复多变残基（RVD）(JoungandSander,2013)。由于RVDs的蛋白结合密码子已经被破译(Bochetal.,2009;MoscouandBogdanove,2009)，这使得设计TALEs成为了可能，TALEs通过设计一个合适的DBD来沉默任意想要的靶向DNA序列。通常，TALEs被设计用来识别15-20个DNA碱基对，平衡伴随有脱靶效应的特异性(Milleretal.,2011;Mussolinoetal.,2011)。这种方法是针对基因组中每一个独特的靶位点，所以需要设计不同的DBDs，每一个DBD由500-700个氨基酸组成，这是一个很冗长的过程。在最近数年里，TALEs的固有的可编辑性被用来执行大量的功能，仅仅通过把各种各样的效应结构域与DBD融合即可。TALETranscriptionalRepressor（TALE转录抑制子）基因沉默借助于KRAB-TALEs达到转录抑制，在KRAB-TALEs中，转录抑制子Kru¨ppel-associatedbox(KRAB)结构域和DBDs融合，从而靶向作用于转录起始位点（TSS）(Congetal.,2012)(Figure1B)(KRAB结构域为一蛋白质-蛋白质相互作用区,可以与多种协同转录抑制因子和转录因子结合)。和RNAi相比，这种方法的一个关键的不同就在于TALE抑制物阻碍了细胞核中靶基因的转录，而RNAi只能于转录后在细胞质中降低它们。这就允许了，例如源于每一个转录序列的功能效应的研究，正如最近对于IncRNAs的描述(Bassettetal.,2014)。另一方面，TALE抑制物模仿了RNAi的亚等位基因效应，如此一来，基因的功能就被抑制了但并不是永久性地破坏，这就是TALENs的实例。TALENTALEDBDs也成功地应用于了哺乳动物突变基因的研究。在这个策略下，将TALEDBDs和核酸酶效应器结构域如Fokl（非特异性核酸内切酶）融合在一起，就形成了TALEN(Gajetal.,2013)。FokI只有在二聚体的形式下才具有活性；如此，TALENs结合于Fokl核酸酶结构域临近的基因组靶位点，在这里，他们造成了DNA双链断裂（DSBs）（Figure1C）。尽管在这个策略中，由于只有在Fokl正确定位和二聚化之后，DSB才会出现，每一个靶位点需要两个TALENs结构，其极大的特异性就是这样实现的(Christianetal.,2010)。一旦出现了DSB，DNA就可以通过两个不同的机制得以修复：高度精确的同源重组修复(HRR)和易出错的非同源末端连接体（NHEJ）(ValerieandPovirk,2003)。通过NHEJ的DSBs的修复时常出现DNA靶位点的删除，插入或替代（Duraietal.,2005）。在TALEN技术中，这就是想要得到的，而且使用者大多通常将TALEN靶向作用于5’基因的外显子，促进早期框移突变或提早终止编码。由于存在着永久性的基因损害，所以一旦突变被引入，就没有必要再持续TALEN活性进入靶细胞。这和RNAi的可逆性质形成了对比，在TALEN中小RNA的丢失相当于其所诱导的表型的丢失。除了可以通过NHEJ引入随机阅读框突变，TALENs也可以用来引入非随机的目的突变，靶向删除，或通过上述的HRR添加长DNA片段。在过去，哺乳动物细胞基因组的编辑最初是通过引入包含有靶位点的同源序列的捐赠者的DNA。然而这种过程对于哺乳动物的细胞作用效率非常低(Vasquezetal.,20