CHIPassary

使用说明：1.样品超声处理条件的优化：A.准备适量冰浴预冷的PBS，以及100mMPMSF。将SDSLysisBuffer适当温浴，使其中的SDS充分溶解，并混匀。B.将细胞培养于10cm细胞培养皿中，细胞培养液的用量为10ml。在预期发生目的蛋白和基因组DNA结合的时间点，直接在细胞培养液中加入适量甲醛，轻轻混匀，至最终浓度为1%。随即在37℃孵育10分钟，以交联目的蛋白和相应的基因组DNA。例如，对于常规的每个10cm细胞培养皿中加入10ml细胞培养液的情况，需加入270微升37%甲醛。请注意尽量使用高质量的在有效使用期限内的甲醛。细胞也可以培养于6cm细胞培养皿中，相关溶液的用量需按照比例进行相应调整。C.加入1.1mlGlycineSolution(10X)，轻轻混匀。室温放置5分钟。D.将有细胞样品的培养皿置于冰浴上。吸尽含甲醛和glycine的培养液，尽量保持没有液体残留。E.在上述室温放置5分钟期间，用冰浴预冷的PBS稀释100mMPMSF至1mM，即配制成冰浴预冷的含1mMPMSF的PBS。PMSF水性溶液一定要新鲜配制，其在水相中的半衰期约为30分钟。F.加入5-10ml冰浴预冷的含1mMPMSF的PBS，洗涤细胞，吸尽液体，尽量保持没有液体残留。G.再加入5-10ml含冰浴预冷的1mMPMSF的PBS，进一步洗涤细胞，吸尽液体，尽量保持没有液体残留。H.加入1ml冰浴预冷的含1mMPMSF的PBS，用细胞刮子刮下细胞，收集至离心管中。如果细胞可以用枪吹打下来，也可以用枪吹打。对细胞进行计数，分装成每管大约100万细胞。I.4℃，800-1000g离心1-2分钟，以充分沉淀细胞。如果发现沉淀不充分，可以适当延长离心时间。吸尽上清，尽量减少液体残留。J.配制适量含有1mMPMSF的SDSLysisBuffer。上一步骤的100万细胞沉淀用0.2ml含有1mMPMSF的SDSLysisBuffer重悬。K.在冰浴上孵育10分钟，以充分裂解细胞。L.超声处理，以剪切基因组DNA，使DNA大部分断裂成200-1000bp大小，如果能把大部分控制在400-800bp则更佳。超声过程中请一定注意要保持样品处于冰浴中，并且处于较低温度。超声剪切的效果在后续去交联后可以用常规的DNA琼脂糖凝胶电泳检测。超声处理的条件通常可以设置为10秒每次，共3-4次，功率为50W时设置为最大功率的30%，采用2mm超声头。不同的超声处理仪器的设置不太一样，摸索超声条件时，可以先固定其他条件，先确定每次超声多长时间不会导致明显发热，然后摸索不同的超声次数。直至找到比较合适的超声次数可以使大部分基因组DNA断裂成200-1000bp大小。需要注意的是每次的超声体积和细胞用量宜固定，否则就不能使用一个相对比较固定的超声条件用于后续实验。M.在0.2ml经过超声处理的样品中加入8微升5MNaCl，混匀。65℃加热4小时，以去除蛋白和基因组DNA之间的交联。N.加入等体积的Tris平衡苯酚，vortex剧烈混匀，随后4℃，12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。O.加入等体积氯仿，vortex剧烈混匀，随后4℃，12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。说明：上述步骤1N和1O的酚氯仿抽提可以使用DNA纯化试剂盒进行操作。例如碧云天的PCR/DNA纯化试剂盒(D0033)。P.取少量通过酚氯仿抽提或DNA纯化试剂盒获得的液体，对于酚氯仿抽提产物可以取5-10微升，对于DNA纯化试剂盒纯化产物可以取2-5微升，进行琼脂糖凝胶电泳，观察超声处理对于基因组DNA的剪切效果。2.染色质免疫沉淀：A.在对样品超声处理条件进行优化后，对于待检测样品按照步骤1A-1K进行操作，并参考步骤1L进行超声处理。B.随后对于经过超声处理的样品在4℃，12000-14000g离心5分钟。取上清(约0.2ml)至一2ml离心管中，置于冰浴。C.配制适量含有1mMPMSF的ChIPDilutionBuffer。加入1.8ml含有1mMPMSF的ChIPDilutionBuffer以稀释经过超声处理的样品，使最终体积为2毫升。D.取出20微升样品作为Input用于后续检测。其余近2ml样品加入70微升ProteinA+GAgarose/SalmonSpermDNA(其中约35微升为沉淀，35微升为液体)，在4℃缓慢转动或摆动混匀30分钟。此步骤的目的是减少ProteinA+GAgarose/SalmonSpermDNA和目的蛋白或目的DNA序列的非特异性结合。E.4℃，1000g左右离心1分钟，将上清转移至一个新的2毫升离心管中。F.加入适量一抗，一抗的用量可以参考抗体的说明书。如果抗体的说明中未给出用于ChIP的稀释比例，可以参考普通的免疫沉淀的稀释比例。通常一抗的用量为0.5-1微克。4℃缓慢转动或摆动混匀过夜。可以不加抗体作为阴性对照，或用无关的抗体作为阴性对照，同时可以用没有细胞样品的溶液作为空白对照。G.加入60微升ProteinA+GAgarose/SalmonSpermDNA(其中约30微升为沉淀，30微升为液体)，在4℃缓慢转动或摆动混匀60分钟，以沉淀一抗识别的蛋白或相应的复合物。H.4℃，1000g左右离心1分钟。非常小心地去除液体，切勿触及沉淀。随后依次用如下溶液对沉淀进行洗涤，每次洗涤液的用量为1ml，每次在4℃缓慢转动或摆动洗涤3-5分钟，随后4℃，1000g左右离心1分钟。非常小心地去除液体，切勿触及沉淀。a.LowSaltImmuneComplexWashBuffer洗涤一次。b.HighSaltImmuneComplexWashBuffer洗涤一次。c.LiClImmuneComplexWashBuffer洗涤一次。d.TEBuffer洗涤两次。说明：完成上述所有洗涤步骤后所获得的沉淀即可用于PCR扩增目的基因序列或用Southern检测目的基因序列，或者用于Western检测等。3.PCR扩增目的基因序列(如果ChIP产物用于检测目的基因序列)：A.新鲜配制适量Elutionbuffer(1%SDS,0.1MNaHCO3)。B.完成步骤2H后，即完成所有洗涤步骤后，加入250微升Elutionbuffer。Vortex混匀，室温转动或摆动继续洗脱3-5分钟。C.1000g左右离心1分钟，将上清转移到一新的离心管中。沉淀中再加入250微升Elutionbuffer。Vortex混匀，室温转动或摆动继续洗脱3-5分钟。D.1000g左右离心1分钟，取出上清。和上一步骤，即步骤3C中获得的上清合并。共计约500微升上清。E.在500微升上清中加入20微升5MNaCl，混匀。65℃加热4小时，以去除蛋白和基因组DNA之间的交联。对于步骤2D获得的作为Input的20微升样品，加入1微升5MNaCl，混匀，65℃加热4小时，同样用于去除蛋白和基因组DNA之间的交联。此步骤完成后可以继续进行后续步骤，也可以先-20℃冻存，第二天继续后续步骤。说明：此时的样品已经可以用于PCR，可以尝试使用1、2、5或10微升样品作为模板用于PCR检测目的基因。此时PCR的效果和可能被沉淀下来的DNA的量，以及整个PCR扩增体系是否容易扩增目的基因有关。如果发现PCR效果欠佳，可以考虑通过后续的纯化步骤，纯化并浓缩样品，然后再进行PCR检测。注意：通常情况下，推荐进行后续纯化后再进行PCR检测，而Input通常不必进行后续纯化步骤。F.在约520微升样品中加入10微升0.5MEDTA，20微升1MTrispH6.5和1微升20mg/ml蛋白酶K。混匀后45℃孵育60分钟。G.加入等体积Tris平衡苯酚，vortex剧烈混匀，随后4℃，12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。H.加入等体积氯仿，vortex剧烈混匀，随后4℃，12000g左右离心5分钟。吸取上清至另一离心管中。I.加入20微克glycogen或yeasttRNA，加入1/10体积的3MNaAc，pH5.2，再加入2.5倍体积无水乙醇。混匀后-70℃沉淀不少于1小时，或-20℃沉淀8小时以上。J.4℃，12000-14000g离心10分钟，小心吸去大部分上清，切勿触及沉淀。K.加入约1ml70%乙醇洗涤沉淀。4℃，12000-14000g离心10分钟，小心吸去大部分上清，切勿接触沉淀。L.4℃，12000-14000g离心1分钟，非常小心地吸除残留液体。M.用少量TE或水重悬DNA沉淀，用于目的基因的PCR检测。用于PCR的引物最好能设计2组，可以用Input作为模板预先摸索出相应的PCR条件，并选择一组效果较好的引物用于最终的PCR检测。少数情况下，当PCR条带过弱时，可以采用nestedPCR技术，进行两轮扩增。说明：步骤G至步骤M也可以采用适当的DNA纯化试剂盒纯化DNA，例如碧云天的PCR/DNA纯化试剂盒(D0033)。4.Western检测ChIP产物(如果ChIP产物用于Western检测)：A.接步骤2H，在完成所有的洗涤步骤后，加入25微升SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X)。SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(1X)可以用SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)用水稀释配制而成。沸水浴煮沸10分钟。B.可以取10-20微升用于Western检测。