Western实验操作原理及方法jst

1蛋白免疫印迹（Westernblotting）实验操作原理及方法一、实验目的：通过本实验，可以特异性的检测蛋白的表达水平。二、实验原理：1、蛋白浓度测定：考马斯亮蓝（CoomassieBrilliantBlue）存在两种不同的颜色形式：红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，结合后燃料演的有红变蓝，最大光吸收由465nm变成595nm。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。此反应大约2min即可完成，并可稳定1小时。2、SDS凝胶：丙烯酰胺（Acr）和甲叉丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（ammoniumpersulfate,(NH4)2S2O8,APS）或核黄素（ribofavin,VB2）和加速剂N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-ytetramethylethylenediamine,TEMED）的作用下，聚合成三维网状结构。*Acr和Bis之比可以决定胶的孔径等因素。浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶。3、SDS-PAGE电泳：SDS是阴离子去垢剂，由于其带有大量负电荷，当与蛋白结合时，所带电荷大大超过了天然蛋白原有的负电荷，因而消除了蛋白之间原有的电荷差异，则电泳迁移率主要依赖于分子量，而与所带净电荷和形状无关。三、实验方法及步骤：样品预处理：1、将细胞从平皿上刮下，离心后，用1XPBS冲洗，12000rpm1min离心，弃上清，细胞沉淀保存于-80℃。2、把细胞沉淀取出，加M-PER或T-PER（Thermo，约为细胞体积的2~3倍），悬浮细胞。10mLM-PER或T-PER+50μL200mMNa3VO4+50μL200mMPMSF+1片IN（Roche，酶抑制剂复合物）3、将装有细胞悬液的Doff管固定在4℃层析柜中的脱色摇床上，maxspeed，剧烈摇1小时。4、冰上，超声破碎（注意先用纯水清洗探头），AmL=35%超声10s，停顿5s，反复10次（探头不能碰到管壁，且始终保持在液面以下，尽量不要产生气泡）5、重新固定在脱色摇床上，4℃，1h，maxspeed。6、离心，12000rpm，4℃，20min7、吸上清于另一Doff管中，保存在-80℃。测定蛋白浓度（Bradford法）：1、测定标准曲线牛血清白蛋白（BSA）标准液的配制：配制1mg/mL的BSA溶液，稀释成浓度梯度为100μg/mL,200μg/mL,400μg/mL,600μg/mL,800μg/mL的标准液。标准曲线的测定：取2μL配好的标准液加入到2mL考马斯亮蓝试剂中，室温放置5min以上，595nm测光吸收值，制成标准曲线。2、测定蛋白样品的浓度①取一定量的蛋白样品加入到2mL稀释好的考马斯亮蓝试剂中，室温放置5min以上，2595nm测光吸收值（OD值0.8时，需要减少反应蛋白的体积）。②通过标准曲线求得未知蛋白的浓度，计算上样体积。制胶：1、分离胶①装好胶板，检验是否漏水，吸干水分。②按一定比例加入各试剂。以浓度为12%的胶（1.5mm厚的胶）为例，依次按顺序加入：1.87mLH2O，3.375mL1MTris-HCl(pH8.8)，3.6mLAcr：Bis（29:1），90μL10%SDS，60μL10%APS，4.5μLTEMED。注：一般1.5mm厚的胶需配9mL，1mm厚的胶需配6mL。Acr：Bis（29:1）有毒，称取时注意防护，待全部溶解后用滤纸过滤，4℃避光保存。10%APS需分装在Doff管中，-20℃避光保存。③混匀，用刻度吸管将混匀的凝胶溶液加到胶板中（贴壁加，避免产生气泡），然后加1mL水或正丁醇封住液面。④待胶凝固，将上层封胶的液体从胶槽的一边倒去，用滤纸条吸干多余水分。2、浓缩胶①按一定比例加入各试剂。以浓度为4.5%的胶（1.5mm厚的胶）为例，依次按顺序加入：2.17mLH2O，0.388mL1MTris-HCl(pH6.8)，0.45mLAcr：Bis（29:1），27μL10%SDS，15μL10%APS，2μLTEMED。注：一般1.5mm厚的胶需配3mL，1mm厚的胶需配2mL。②混匀，缓慢加入胶板中，小心插上梳子。③准备沸水浴，准备上样体系。样品制备：1、根据标准曲线和样品OD值算出样品浓度和上样体积（不宜超过50μL），用1XPBS补足到相同的上样体积。先加1XPBS，再加样品和5Xloadingbuffer（使用前加5%BME），混匀。2、用小夹子夹住Doff管，沸水浴中8min。电泳：1、配制1Xrunningbuffer并加SDS（SDS的终浓度为0.1%）。2、取下胶板上的梳子，把胶板底部打开为半开，将电泳液倒入电泳槽中，没过胶板。3、上样，动作要慢，切忌溢入旁边的胶孔，marker上4μL。4、上槽接正极，下槽接负极，30mA，约1-1.5h，当溴酚蓝前沿到达胶的底部时，停止电泳。转膜：1、准备1Ltransferringbuffer，使用前先置于4℃预冷。2、在容器中倒入适量transferringbuffer，浸泡滤纸4张，海绵2片，纤维素膜或PVDF膜1片。3、电泳结束后，取下胶板，卸下胶框，撬开短玻璃板，在凝胶上切一小角作为加样标志。4、将胶块的浓缩胶切除丢弃，分离胶取出浸泡在transferringbuffer中。5、制作转膜三明治：负极-一层海绵-两层滤纸-胶-纤维素膜-两层滤纸-一层海绵-正极注：胶放在负极面，整个操作在buffer中进行，赶走所有气泡。6、将“三明治”放入电泳槽中，倒满transferringbuffer，注意电泳槽的正负极。7、电泳槽放入冰盆中，4℃层析柜中转膜3小时（180mA，将电压调到最大），也可转3膜过夜。免疫杂交与显色：1、将膜取出，PBST洗膜一次。2、将膜放入封闭缓冲液中（10%脱脂奶），脱色摇床摇动1小时，RT。3、用PBST洗膜3次，每次5min。4、将膜封入袋中，加一抗，赶走气泡，封口，4℃摇过夜或室温下3h。一抗置冰上，用1%BSA（溶于PBS中）稀释一抗。5、将膜取出，一抗回收，膜用PBST洗3次，5min/次。6、将膜再次封入袋中，加二抗，赶走气泡，封口，摇动1小时，RT。二抗置冰上，用PBST稀释二抗。7、洗膜，10min/次，3次；取出ECL试剂，打开洗片机。8、将膜放在干净的一次性手套上，正面朝上，每毫升ECL试剂加入3μL4%的过氧化氢，混匀后加在膜上（一张2X6cm的膜用1mL），反应1min。9、将膜沥掉ECL液体，移到暗盒中（正面朝上），覆上透明的薄膜，拿到暗室。10、在暗室中，取出X光胶片，压到膜上，反应1-2min（具体时间视荧光强度而定），送进洗片机洗片。剥离（Stripping）：1、PBST洗一次，5min。2、加入strippingbuffer，10min，RT。3、PBST洗三次，5min/次。4、10%脱脂奶粉封闭。5、以下步骤同上。四、试剂配制：1、30%丙烯酰胺溶液200mLAcr58gBis2g注意：Acr有很强的神经毒性，操作过程中注意防护，配制中用到的器皿及污染的地方也因及时清理。完全溶解后用滤纸过滤，4℃避光保存。2、Tris-HCl，1M，pH8.8及pH6.8，各500mLTris60.5g12NHCl，调pH至8.8和6.8定容至500mL3、10%APS20mLAPS2gH2O20mL分装于Doff管中，存于-20℃4、5XSDS-PAGEloadingbuffer10mL终浓度10%SDS5mL5%甘油2.5mL25%1MTris-HCl，pH6.81.55mL155mM溴酚蓝5mg0.5mg/mLH2O0.45mL分装后室温保存使用前加入巯基乙醇（BME），使终浓度为5%45、10XSDS-PAGErunningbufferTris30.2gGlycine144gH2O1000mL室温保存使用时加入10mL10%SDS，使其终浓度为0.1%6、Transferringbuffer1L10*runningbuffer(无SDS)100mL甲醇200mLH2O700mL7、PBST1L10*PBS100mL5%Tween-2010mL8、10%脱脂奶粉PBST45mLNonfat-milk4.5g五、注意事项：1、本实验中涉及的丙烯酰胺（Acr）、甲叉丙烯酰胺（Bis）、N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-ytetramethylethylenediamine,TEMED）、β巯基乙醇（BME）、SDS，均有毒性，操作过程中注意防护，其中TEMED和BME需在通风橱内操作。2、10%脱脂奶粉和用1XBSA稀释的一抗可以重复使用，但如果发现其长菌或变质，应立即更换。3、Runningbuffer和Transferringbuffer可重复使用最多5次。4、硝酸纤维素膜应避光防潮保存。六、常见问题和参考解决方案：1、电泳中出现的问题：出现的问题可能的原因解决的方法推荐电压条件下电泳时间过长电泳缓冲液过稀配制新鲜缓冲液，使用1×稀释液推荐电压条件下电流过高，热量过大电泳缓冲液过稀配制新鲜缓冲液，使用1×稀释液推荐电压条件下电流过低或无电流接触不良在电泳前移除胶盒底部的封条；确认缓冲液没过加样孔；检查导线连接蛋白带型条状（streak）上样过量，样品中盐浓度过高降低蛋白上样量，通过透析或凝胶过滤降低样品中的盐浓度样品沉淀加大样品中SDS的浓度样品中的污染，如脂类或DNA复合物离心或过滤样品以除去特定污染5制胶不佳确保灌胶均匀，一次完成条带模糊蛋白样品部分变性完全变性蛋白蛋白样品部分还原确保加入足够量的DTT或β巯基乙醇电泳时间过长观察前面的指示剂染料，掌握恰当的电泳时间哑铃形条带或“微笑”条带上样体积过大导致不完全堆积使用恰当的上样体积。如果样品过稀，使用超滤浓缩电泳过程中电场不均匀如果蛋白浓度已知，上样时确保对称分离胶表面不平在制胶时使分离胶表面水平凝胶过期在指定的失效期前使用凝胶2、显影中出现的问题：出现的问题可能的原因解决的方法反影(白色条带,黑色背景)HRP过高(背景较高)至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1显影后膜上条带处变为黄色HRP过高(敏感性太高)至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2信号弱或无HRP过高引起底物迅速耗竭至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3抗体-抗原系统敏感性过低提高抗体浓度/蛋白上样量*注4转膜不充分/过转优化转膜条件*注5HRP或底物活性降低测试活性或选用敏感底物*注6高背景HRP过高(背景较高至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7封闭时间不足延长封闭时间4度过夜最好*注8抗体与封闭液有交叉更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9TBST洗脱不足增加洗脱时间、次数、用量*注10曝光时间过长降低曝光时间*注11抗原-抗体浓度过高降低抗体浓度或蛋白上样量*注12条带内有白点转膜不良（如有气精细操作*注136泡在胶-膜之间)膜平衡不均/油脂污染按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14膜与X光片间有气泡显影前去除气泡非特异性条带抗体交叉反应至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注15SDS非特异性结合蛋白条带使用无SDS转膜液散在小圆斑封闭液有杂质颗静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注16*注1其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带。形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因3的现象。在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗。如是则要么通过降低抗体解决，要么动作迅速早期未耗竭底物时压片，否则一旦耗竭通过减少压片时间不能解决问题。也可以过一段时间?RP稍减后重加底物迅速压片。还有另外一种反影现象就是压出条带粗大模糊，但条带中心是空的白色，原因和上面的一样，主要是条带中心耗竭底物引起的，也可以在暗室看到中空的荧光带，但与上面的区别主要在于特异性要好一些，若继续发展则就是原因3的现象。其分析和解决