RAPD技术及其在动物育种中的应用

RAPD技术及其在动物育种中的应用摘要:综合论述了RAPD技术是20世纪90年代建立起来是新型分子遗传标记技术,问世不久,PAPD分析就以其简单、快捷、低廉、多态性丰富的特点,在基因组研究的各个领域,尤其在动物遗传育种中应用广泛。关键词:RAPD技术;分子标记;基因组；动物育种Abstract：ComprehensivelydiscussestheRAPDtechnologywasfoundedinthe1990sisanewmoleculargeneticmarkers,wasnotLong,PAPDanalysisonthecharacteristicsofsimple,quick,cheapandrichpolymorphism,intheareasofgenomicsresearch,especiallywidelyusedinanimalgeneticbreeding.Keywords：molecularmarkers;RAPD;PCR;animalbreeding;二十世纪七十年代以来,随着分子生物学技术的迅速发展,限制性酶切片断长度多态性(Restrictionfragmentlengthpolymorphisms)及其它—DNA多态性检测技术的出现,PCR(polymerasechainreaction)技术的兴起和电泳技术不断完善,分子遗传标记已逐渐成为热点,在此基础上,发展了多种检测DNA技术,如:扩增片段长度性(AFLP)、单链构象多态性(PCR-SSCP)、数目可变的串联重复序列(VNTR)、随机扩增DNA多态性(RAPD)。RAPD技术是一种新型的分子遗传标记技术,是以PCR扩增技术为核心发展起来的。RAPD问世仅十年,就以其独到的检测DNA多态性的方式以及酶感度高、快速、简便的特点迅速渗透于基因组研究的各个领域,尤其为动物遗传育种学家所关注,本文将对RAPD的研究现状及其在动物遗传育种中的应用作简要概述。1RAPD技术的原理在Millis等(1986)首创聚合酶链式反应(PCR)技术以后,以美国杜邦公司科学家Willians和加里福利亚生物研究所Welsh为首的两个研究小组于1990年几乎同时建立了检测随机扩增DNA(RAPD)的分子生物技术。它利用一系列不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单(通常为9～10聚体,G+C含量不少于40%,一般较高,达60%以上)为引物,对所研究的基因DNA进行PCR扩增,如果两个引物与模板的结合位点之间距离在可扩增的范围(约200-4000bp)之内,而且分别位于互补的两条链,同时出现以下情况都能检测到DNA上的多态;①两个或其中一个引物结合位点的碱基突变,表现为特定扩增带的有无;②原来的非结合位点的碱基突变结合位点时,表现为扩增带的增减;③退火位点间的插入或缺失而导致扩增距离改变,表现为扩增产物长度变化或扩增产物的有无。2RAPD的优缺点2.1RAPD的优点RAPD是一种新型的分子遗传标记,除了具有其它一些分子标记(RFLP、SSR、AFLP等)的共同优点,如检测不受年龄、性别、发育阶段或外界环境的影响外,还具有如下几个优点:①无需预先知道所研究的生物基因DNA序列,因而可用于所有生物体;②引物为人工定序合成,且合成的一套引物无种属特异性,可在实验室进行交换;③每个RAPD标记相当于基因DNA上的一个靶序列位点(SequenceTaggedSites),一套引物可检测整个DNA多态性;④避开了繁琐的分子分离、DNA探针、Southern吸印、同位素标记、分子杂交及测序分析等一系列前期工作;⑤所需DNA量少,一次反应仅需10～50ng。2.2RAPD的不足RAPD是在PCR技术基础上发展起来的检测技术,所以它不可避免的继承了PCR技术的一些缺陷,另外还有其它一些特点:①绝大多数RAPD标记不能鉴别杂合体;②RAPD产生的多态性是随机的,所以不能单独地用来对没有基因标记的生物进行遗传图谱分析;③RAPD引物合成是随机的,所以对不同的实验材料,大量的引物筛选可能是不可避免;④RAPD技术受PCR扩增因素影响很多,如:模板、纯度、退火温度、Mg++浓度、TaqDNA聚合酶浓度,因此,试验结果存在不稳定、重复性差等现象。⑤RAPD的高变异性,即使在亲缘关系很近的物种之中,其合成的谱带也可能有差异,致使在某一杂交组合中找到的RAPD标记,在另一杂交组合中不一定适用,而需对大量引物重新筛选。然而,RAPD技术的这些缺点可以通过以下途径进行完善和改进:①采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(RAGE)、变性凝胶梯度电泳或温度范围凝胶电泳(TSGE)以取代琼脂糖凝胶电泳,可大大提高对DNA片段的分辨力。Lsmail等人对谷类植物的RAPD分析中,利用DGGE检测多态位点更加丰富,RAPD多态标记增加30%～50%。R.G.Novy等人通过PAGE电泳分离检测到越橘的一对共显性RAPD标记,而在琼脂糖凝胶中表现为单态(同一条带);②一旦确定最佳反应体系就严格遵循,规范操作,尽可能使RAPD反应标准化;③将RAPD标记进行回收、克隆和纯化,将RAPD标记中的混合片段转化为等位特异性PCR(AS-PCR)或序列特异性扩增区SCAR标记,或将其中的单拷贝序列转化为RFLP标记的一个探针或STS标记(SequenceTagedSite)以解决RAPD标记混合标记问题,又能把显性标记转化为共显性标记,同时提高RAPD标记的稳定性和重复性。3RAPD在动物遗传育种中的应用RAPD技术以其突出的优点,在生物遗传变异研究、基因定位、动物遗传连锁图谱构建、特定基因的鉴定和分离等方面表现出极大的实用价值。3.1品种(系)类群鉴定及分类在生产实践中,种质资源的鉴定主要依据外型、生产性状的差异来区分,这些差异受各种因素的影响,所以也影响了鉴定的准确性,而RAPD技术是在分子水平上的多态性检测技术,所以一问世,各国学者就对其在此领域应用的可能性作了深入的研究,Welsh等(1990)用3个引物构建了8个品系小鼠的特异性RAPD图谱。EzerAD对7个品种狗的RAPD资料进行分析结果表明,RAPD技术能够产生鉴别狗品种的DNA指纹图谱。Gwakise(1994)用141个随机引物对三个瘤牛品种进行了RAPD分析,筛选了IL0865和IL01127两对引物扩增具有品种特征。刘德武等用140个随机引物对六个品种猪的池DAN进行PCR扩增,发现引物的扩增产物可明显的区别外来猪与地方猪种,可作为外来品种与地方品种区别的RAPD标记。陆仁后等(1995)对4种十足目动物的RAPD分析结果表明,RAPD分析可观察到显著的差异。SJKemp和AJTeale等利用80个随机引物对非洲瘤牛(Bindicus)和具有抗锥虫病特性的家牛(Btaurus)群体的DNA池进行PAPD分析,发现其中一个引物IL0526的480bp扩增片段为家牛所特有,另外,还有IL01056引物检测到一个长1.1Kb的瘤牛公牛特异性标记。3.2群体遗传结构及遣传多样性分析RAPD分析法非常适用于种间特别是种下类群的群体结构、遗传多样性以及物种间亲缘关系研究,Smith(1996)对四个品种鸡和两个品种火鸡品系进行RAPD分析,成功地扩增出鸡与火鸡的特异性DNA片段,并计算出群间遗传距离,绘出的遗传关系树状图与种群间的系统发育关系相一致。黄勇富等(1997)对四川省四大地方品种猪的亲缘关系及遗传多样性进行研究,根据扩增图谱技术计算出遗传距离指数和遗传多样性指数,计算结果表明,内江猪、雅南猪和成华猪间亲缘关系较近,荣昌猪与这三个品种亲缘关系较远,而遗传多样性为荣昌猪最为丰富,其次为内江猪,成华猪最为贫乏。张锡元等(1999)对长江鲢和鳙群体的RAPD分析表明,它们的遗传相似度分别为0.9528和0.9614,两种鱼的遗传多样性都比较低,他们认为这与鲢、鳙等鱼在长江水系的天然产卵场的破坏,资源明显减少有密切的关系。RAPD技术在物种遗传结构、遗传多样性研究、亲缘关系的确定等方面越来越显示出它巨大的应用潜力,并得到了群体遗传学家的关注。3.3基因定位与遗传图谱的构建运用RAPD技术可在一次反应中检测基因组的多个位点,因此它可迅速寻找两组DNA样品间多态性差异,进而得到与此差异区域相连锁的DNA标记,这样利用RAPD即可定位某一特定DNA区域内的特定基因(目标基因),也可为RFLP连锁图提供新的标记。胡刚安等(1997)以岭南黄鸡A系和清远麻鸡为亲本组建F2分离群体,以内感区间作图法对鸡19种产肉性状基因位点进行定位和效应分析,构建了一包含32个RAPD标记的鸡RAPD连琐图谱,检测到控制17种产肉性状的QTL35个,并定位于5个连锁群的13个标记区间。Welsh(1991)利用RAPD技术构建了鼠CBL/6J×DBA/2J重组近交系个体及亲本基因组指纹图谱,用一个引物Kpn-R定位了4个多态性位点,用引物Kpn-R在亲本C57BK/6J和DBA/2J间通过RAPD检测出6条多态性DNA片段,其中除Kpn-360与原已建立的遗传图谱中的DNA未表现出紧密连锁外,其余几条Kpn-310、Kpn-235、Kpn-185、Kpn-175均定位于遗传图谱上。Levin(1994)构建的鸡遗传图谱中包含98个遗传标记,其中RAPD标记就占42个,他还利用回交作图群体将13个RAPD标记定位于Z染色体上,这些标记几乎与Z染色体上有关的所有经济性状相连锁。Johnson(1994)则利用116个引物产生的413个遗传标记建立了Zebrafish的遗传图谱。Woodward等(1990)对近交小鼠品系用481条随机引物检出95个RAPD多态位点,结合重组近交系分析,构建了含有76个多态标记的遗传图谱。RAPD技术在基因组研究方面表现出其独到的特点和优势,它可以快速的进行基因定位和遗传图谱构建,而不需先克隆标记或进行序列分析,这是利用RFLP、重复序列基因组作图所无法做到的,当然仅靠RAPD标记进行基因定位是困难的,要几种遗传标记同时应用,这样才能增加基因定位的准确性。3.4标记辅助选择(MarkAssisitedSelection,MAS)近年来,畜禽业遗传作图研究取得了很大进展,这就为利用DNA标记进行数量性状位点(QTLS)的鉴别和定位奠定了基础。目前,畜禽重要数量性状的QTLs及其遗传标记的研究已成为热点,而利用DNA遗传标记对畜禽进行辅助育种已成为动物育种过程中的一个重要手段和方法。RAPD标记辅助选择有助于动物育种是动物育种界的共识,它的优点主要是:①提高了选种的准确性;②可利用非加性效应,即显性效应和上位效应;③提高了选择差和选择强度,缩短了世代间隔;④可能培育出本来难于兼有的几类优良性状结合于一身的新的合成群体。谢新明等(1998)用RAPD技术及广义线形模型(GeneralLinerModer,GLM)对猪的平均日增瘦肉量进行分析,结果筛选出随机引物S35相对分子量为1375～1904碱基对之间有两条RAPD多态性条带对猪平均日增瘦肉量存在显著效应,同时证明RAPD技术有可能应用于猪平均日增瘦肉量的标记辅助选择。戴国俊(2000)以新扬州鸡为试验材料,进行RAPD扩增,筛选出随机引物OPA-02的两条多态性条带组合AY02A、AY02C对56日龄增重(日均增重)、屠体重、半净膛重、全净膛重有显著影响,可用于标记辅助选择。WeiR利用RAPD技术对洛岛红近交系与白来航的杂交群体进行了研究,共检测到16个RAPD标记,他指出这些标记可用于今后产蛋性状的QTL检测。利用RAPD标记对数量性状进行间接选择,首先要找到对某一生产性能存在显著效应的RAPD标记,从理论上讲,随着引物数的增加,RAPD分析的位点可覆盖整个基因组DNA,这给通过RAPD分析寻找标记与数量性状位点的关联提供了广阔的空间。4结束语尽管RAPD技术存在着隐定性、重复性差等缺点,但是这些缺陷可通过一定的途径加以改进和完善,如规范操作,分析标准化,与RFLPS等分子标记相互配合等等。另外,RAPD分析简单