栀子蓝色素制备及纯化工艺的研究

，张芳1，李梅2，甘纯玑21福建农林大学食品科学学院，福州(350002)2福建农林大学生命科学学院，福州(350002)E-mail：[e-mail]摘要：本文采用纤维素酶水解京尼平甙生成京尼平，京尼平再与氨基酸合成栀子蓝色素，利用超滤技术对其进行分离、纯化。通过一系列的单因素实验和正交实验，探讨了制备及纯化栀子蓝色素的工艺条件。结果表明，最佳工艺条件为以谷氨酸钠作为氨基酸来源，液固比（V/W）=8:1，酶解时间12h，纤维素酶与京尼平甙的质量比1：8，氨基酸与京尼平甙的质量比1:2，反应时间96h。最佳超滤纯化工艺为超滤膜截至分子量为5000Da，超滤压力0.5-0.8MPa，pH7,超滤温度为室温。经HPLC测定，经本工艺制备的栀子蓝色素色价E590nm1cm（1％）≥192，纯度≥95％。关键词：栀子蓝色素；超滤；纤维素酶；HPLC中图分类号：TS202.3栀子蓝色素是近年来广受关注的一种天然水溶性蓝色素[1,2]。它是以茜草科植物—栀子中所含的化学成分京尼平甙（geniposide）为原料，利用β-1,4-葡糖甙酶(EC3.2.1.21,betaglucosedase)酶解京尼平甙（geniposide），脱去其分子末端的葡萄糖基（glu），得到京尼平（genipin），京尼平（genipin）再与氨基酸发生一系列的聚合、重排反应，反应完成后，经干燥即可制得栀子蓝色素[3]。当前栀子蓝色素的制备主要采用高产β-1,4-葡糖甙酶的微生物进行发酵[4,5]，而后一般采用大孔树脂对发酵液进行脱盐、精制和纯化[6]。这种工艺存在着培养基与色素分离困难，树脂不易再生，纯化效率低，产品色价较低等诸多问题，影响色素制品的应用。因此有必要改进其生产工艺对其进行进一步的分离纯化研究。超滤是一种新兴的生化分离技术，广泛应用于化工、食品、医药及废水处理等领域。[7]超滤不但具有耗能低、单级分离效率高，工艺简单等优点，而且分离纯化所得制品的收率高。本文采用纤维素酶酶解京尼平甙，利用超滤技术对栀子蓝色素进行分离纯化，以HPLC为检测手段，通过设置单因素实验和正交实验确定制备及纯化栀子蓝色素的最佳工艺条件。旨在提供一种经济、简单和高效的栀子蓝色素生产工艺。1.材料与方法1.1材料和试剂京尼平甙（福州海东生物科技公司提供）；纤维素酶（无锡酶制剂厂）；谷氨酸钠（福州味精厂）；醋酸和醋酸钠（AR）1.2仪器及设备LGJ1.5真空冷冻干燥机（军事医学科学院北京四环仪器厂）；UV—1600分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；高效液相色谱仪（美国Waters公司）；二极管阵列检测器（美国Waters公司）键合相凝胶柱（Biosep-SEC-S2000键合相凝胶柱，300×7.8mm）；螺旋板式超滤机（厦门福美生物科技有限公司）；超滤膜（聚砜材料膜）栀子蓝色素制备工艺流程：纤维素酶→酶液→京尼平甙酶解→京尼平→氨基酸聚合→栀子蓝色素溶液→超滤（UF）→冷冻干燥→栀子蓝色素粉末1.3.2纤维素酶液制备方法：取纤维素酶粉末，溶于pH4.5的HAc-NaAc缓冲液中。50℃下振荡提取30min后，经抽滤，收集滤出液即得所需的纤维素酶液。1.3.3色素色价的测定及计算方法：栀子蓝色素（粉末）的色价可按下式计算：E590nm1cm（1％）＝A×f/(m×100)（a）式中，A：以1cm玻璃比色皿在蒸馏水做参照下，在590nm的波长下测得的吸光度值f：稀释倍率m：栀子蓝色素的粉末质量测定方法:准确称取一定质量的栀子蓝色素粉末，溶解于蒸馏水中，稀释到适当倍数后，用容量瓶定容，以以1cm玻璃比色皿在蒸馏水做参照下，在590nm的波长下测定其吸光度值，代入(a)式计算1.3.4吸光度增长率的测定及计算：每12h取反应液1ml稀释至其吸光度A在0.3—0.8之间，计算反应体系总的吸光度，并分别与初始溶液的吸光值进行比较，按以下公式计算反应的吸光度增长率：吸光度增长率（%）＝（J－J0）/J0J=A×f×V式中，J为设定时间后所测得的体系总的吸光度；J0为初始体系溶液总的吸光度A为由1ml反应液稀释所得样品在595nm以蒸馏水作参比测定吸光值；f为其稀释倍数；V为反应体系总体积。1.3.5HPLC分析方法：固定相：键合相凝胶柱（300×7.8mm），流动相：水（色谱纯），进样体积：50.00µl，运行时间：30min1.3.6正交实验因素和水平的确定表1L9（34）正交实验因素与水平表Table1FactorsandlevelsdesignofL9（34）orthogonaltestABCD料液比（g/ml）酶解时间（h）酶甙比氨基酸与甙比11:1061:125:1021:8121:107:1031:6201:89:10其中，料液比＝京尼平甙的质量/反应体系总体积酶甙比＝酶的质量/京尼平甙的质量氨基酸与甙比＝氨基酸质量/京尼平甙的质量1.3.7膜通量的计算：膜通量按下式计算J=V/(A×t)式中J为膜通量（Lm-2h-1）,V为透析液体积（L），A为膜的有效面积（m2）1.3.8在线监测透析液的灰分采用电导率法监控透析液中的灰分，电导率的变化可以反映灰分含量的变化情况。2.结果与分析2.1纤维素酶解法制备栀子蓝色素工艺的优化2.1.1氨基酸反应时间对栀子蓝产率的影响取谷氨酸钠做为氨基酸的来源，控制实验条件为：料液比1:8,酶甙比1:8,氨基酸与甙比5:10。50℃恒温条件下，京尼平甙酶解12小时后加入谷氨酸钠继续反应并每隔12小时取样测定样品在595nm下的吸光度。按1.3.4所述方法计算色素吸光度增量率，结果如图1所示：010020030040050001224364860728496108120时间/h色素吸光度增长率/%图1氨基酸反应时间对栀子蓝产率的影响Fig.1Effctofaminoacidsreactiontimeonthepigmentyield如图1所示，0-96h内色素吸光度增长率逐渐增加且增长速度逐渐变缓，反应96h后，色素吸光度增长率基本保持不变。故可确定京尼平与氨基酸的反应时间为96h。2.1.2氨基酸种类对栀子蓝色素产率的影响控制试验条件为：料液比1:8,酶甙比1:8，纤维素酶酶解京尼平甙12h，氨基酸与甙比1:2，分别用谷氨酸、谷氨酸钠、亮氨酸、甘氨酸和组氨酸作为氨基酸来源做平行实验，试验经HPLC测定，结果如下：氨基酸种类谷氨酸钠亮氨酸组氨酸谷氨酸甘氨酸最大吸收峰（nm）594.5595.7594.5590.8587.1栀子蓝峰高的校正系数α11.6630.731.432.17从表2中的结果可以看出，（1）谷氨酸钠和亮氨酸体系的最大吸收波长为595nm，可以产生色调纯正的蓝色，经比较可以发现：亮氨酸色谱峰面积校正系数为1.66，但谷氨酸钠体系却有着成本低廉、来源广泛等优势[6]，故对于工业生产，选择谷氨酸钠作为原料具有现实意义。（2）谷氨酸和甘氨酸体系反应色素最大吸收峰紫移，该色素如果能够与红色素调和成为葡萄紫将会有新的应用前景。2.1.3纤维素酶量对栀子蓝产率的影响取谷氨酸钠作为氨基酸来源,控制实验条件为:酶解时间12h，料液比1:8，氨基酸与甙比5:10,做五组平行实验设定酶甙比分别为1:4,1:6,1:8,1:10,1:12,与氨基酸反应96h后测定吸光度增长率如图2所示3503904304705104681012甙酶比色素吸光度增长率/％图2酶量对栀子蓝色素产率的影响Fig.2Theeffectofcolluloseenzymeusedinreactiononthepigmentyield从图2可知，酶甙比为1:8时色素吸光度增长率最高，这是由于当纤维素酶用量过少时，不能使底物京尼平甙充分酶解为京尼平从而影响了后期与氨基酸的显色反应，而纤维素酶用量过多后，可能由于引入过多的杂质影响了栀子蓝色素的品质。2.1.4料液比对栀子蓝产率的影响进行料液比的单因素试验，控制条件如下：酶甙比1:8，氨基酸与甙比5:10，取谷氨酸钠作为氨基酸的来源,做三组平行实验使反应体系料液比分别为1:10,1:8,1:6,每隔12h取样测量体系反应液的总的的吸光度并计算其色素吸光度增长率,测量计算所得结果如图3所示：结果表明，在一定的范围内随着料液比的增大，色素吸光度增长率也增大，色素的产量也将增大，考虑到实际情况料液比为1:6的反应体系效果最好。2.1.5正交实验L9（34）正交试验结果如表3所示，观察R值结果表明，酶解时间和酶甙比对色素色价的影响显著，其次是氨基酸与甙比的影响，反应体系的料液比影响最小；经计算分析栀子蓝色素产量最高的因素水平是：料液比1:8，酶解时间6小时，酶甙比1:8，氨基酸与甙比5:10；而直接从正交表观察得到的最佳因素水平是料液比1:8，酶解时间12小时，酶甙比1:8，氨基酸与甙比5:10。为确定最佳因素水平，进行验证实验。控制反应条件为料液比1:8，酶解时间6小时，酶甙比1:8，氨基酸与甙比5:10。产品经干燥后测得色价E590nm1cm（1％）为79.3，综合考虑可确定制备栀子蓝色素的最佳工艺条件为最高的因素水平是：料液比1:8，酶解时间12小时，酶甙比1:8，氨基酸与甙比5:10。表3L9（34）正交试验结果表Tab3ResultsofL9（34）orthogonaltest实验号ABCD实验结果Y（色价E1%1cm）1111177.642122267.953133369.174212380.595223185.706231249.507313283.778321357.609332169.44T1214.76242.0184.74232.78T2215.79211.25217.98201.22T3210.81188.11238.64207.36T171.5980.6761.5877.59012345601224364860728496108120时间/h色素吸光度增长率(%)1:101:81:6超滤（UF）纯化栀子蓝色素工艺的优化2.2.1压力对膜通量的影响图4表明压力对膜通量的影响。以温度为25℃和pH7为约束条件，使操作压力从0.33Mpa逐渐上升到0.77Mpa，发现膜通量随着压力的增大而增大，而且在压力较少时膜通量变化幅度较大，当压力超过0.77Mpa后，其增大变化率趋于平缓。05101520250.330.660.991.32压力（Mpa）膜通量（L/M2*H)*0.01图4压力对膜通量的影响Fig.4Theeffectofpressureonmembraneflux这是因为超滤(UF)过程是以压力为驱动力，其大小会直接影响膜通量。实验结果表明，在运行中随着浓度极化加剧，逐步形成凝胶层，膜通量趋于极限值，所以不再随压力的增大而增大。考虑到实际情况故选择0.5-0.8Mpa为超滤最适压力。2.2.2pH对膜通量的影响以25℃，超滤压力0.6Mpa为约束条件，调节料液pH按1.5.2方法进行超滤(UF)，其结果用图5表示0510152035791113料液pH膜通量(L/M2*h)*0.01图5pH对膜通量的影响Fig.5Theeffec