分子生物学实用技术实验操作教程

分子生物学实用技术（S219）实验操作教程西南大学农学与生命科学学院柴友荣研究员1实验一CTAB法提取植物基因组总DNA及分析一、实验目的分离纯化植物DNA是植物分子生物学和基因工程的基本技术要求，CTAB法是提取植物基因组DNA的一种新型方法，可以抽提许多其它方法难以抽提的植物材料（如含多酚较多的植物材料、干燥后的茶叶、老树根等）中的DNA，得率高，质量好，用于PCR、Southern杂交、分子标记、DNA文库构建等。二、基本原理植物材料在液氮中研磨可以迅速破坏其细胞壁，游离出细胞器和原生质，并防止DNA降解。采用CTAB（十六烷基三甲基溴化胺，一种非离子型去污剂）抽提液抽提（65℃）上述研磨物，在高盐条件下不但溶解细胞膜相物质，而且CTAB与核酸形成可溶性的复合物，采用离心可以将变性的蛋白质和多酚、多糖等杂质（沉淀相）去除，水相中含有核酸与CTAB的复合物及其它可溶性的杂质。直接向水相中加入异丙醇则导致核酸的沉淀，CTAB和其它多数杂质留于异丙醇与水的混合相中，吸出核酸沉淀团经过多次乙醇漂洗和沉淀、TE溶解得到DNA粗提物。粗提的DNA一般可用于粗略PCR等。用于精细PCR、Southern杂交和DNA文库构建的DNA则应进一步纯化。用RNase水解RNA，用酚/氯仿/异戊醇和氯仿/异戊醇抽提去除蛋白杂质等，经乙醇沉淀后可获得较为纯净的植物总DNA。三、实验材料甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)幼叶。四、主要仪器设备及耗材Eppendorf5804R低温离心机，HettichUniversal32R低温离心机，EppendorfMinispin离心机，SanyoSIM-F124制冰机，TOMYSS-325自动灭菌锅，MilliporeElix纯水系统，Eppendorfresearch微量移液器系列，GingTianJA2003A电子天平，SatoriusPB-10pH计，HH·S21-4-S恒温水浴锅，UVPGDS8000自动高效紫外透视成像仪，DYY-8C型双稳定时电泳仪及水平电泳槽，GenespecI快速核酸蛋白自动分析仪，长岭BCD-239家用冰箱，TNZ-30-50液氮生物容器及液氮，微波炉，研钵，离心管（15ml、1.5ml），枪头（10、200和1000μl），两面板，枪头盒，离心管盒（1.5ml）等。五、主要试剂1、CTAB抽提液：2%（w/v）CTAB100mmol/LTris-HCl（pH=8.0）20mmol/LEDTA（pH=8.0）1.4mol/LNaCl最后pH值8.0。抽提含多酚较多的植物材料时，上述抽提液中可另加入2%的PVP（聚乙烯吡咯烷酮）。抽提液于室温保存，可在几年内保持稳定。临用之前向装有上述抽提液的试管中加入终浓度为2%-3%（v/v）的β-巯基乙醇。2、醋酸钠溶液：3mol/LNaAc，用冰乙酸调pH值至5.2。3、TE溶液：100mmol/LTris-HCl1.00mmol/LEDTA最后pH值8.0。4、其它：无水乙醇，异丙醇，75％乙醇，酚/氯仿/异戊醇（25：24：1），氯仿/异戊醇（24：1），β-巯基乙醇，重蒸水，单蒸水，RNaseA(10μg/μl)，琼脂糖，6×上样缓冲液，λHindIIIDNAmarker，EB溶液（0.25μg/ml），1×TAE缓冲液。六、实验步骤（一）、DNA的粗提A)向15ml离心管中预先加入5mlCTAB抽提液及0.1ml的β-巯基乙醇，混匀，65℃预热；B)1.00g幼叶用液氮磨成粉末，迅速用药勺转入该15ml离心管中，盖严后迅速摇匀；分子生物学实用技术（S219）实验操作教程西南大学农学与生命科学学院柴友荣研究员2C)于65℃水浴45min，中途间隔轻柔颠倒混匀3-4次；D)冷却后加入等体积(5ml)氯仿/异戊醇，轻柔颠倒混匀使乳化10min；E)10000rpm室温离心10min；F)吸取上清于另一干净的15ml离心管中；G)加入与上清液等体积（约5ml）的异丙醇，颠倒混匀，约1至2分钟后应有白色絮状沉淀出现；H)（若没有，则加入上清液1/5至1/10体积即0.5-1.0ml的醋酸钠溶液，混匀至形成沉淀团）；I)用尖头剪大的1.5ml枪头吸住沉淀团，移入盛有1ml75%乙醇的1.5ml离心管中。若无法直接吸取，则于4℃、1000rpm离心3min收集沉淀DNA；J)在75%乙醇中漂洗沉淀DNA数分钟以上，用枪头吸干乙醇；K)用0.5ml75%乙醇再漂洗2次；L)无水乙醇漂洗1次；M)沉淀于室温或37℃以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明，不要过度干燥；N)用500μlTE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，DNA粗提物可用于粗略PCR等。（二）、DNA的纯化A)向TE溶解的DNA粗提物中加入4-10μlRNaseA(约40-100μg)，轻柔混匀；B)于65℃酶解RNA30min以上；C)加入500μl酚/氯仿/异戊醇，轻轻颠倒混匀使乳化10min；D)10000rpm常温离心10min，吸取上清至1新的1.5ml离心管中，注意勿破坏界面相；E)加入500μl氯仿/异戊醇轻轻颠倒乳化10min；F)10000rpm常温离心10min，吸取上清至1新的1.5离心管中，注意勿破坏界面相；G)向上清中加入1/5-1/10体积的醋酸钠溶液，并加入2.5倍体积无水乙醇，冰浴沉淀30min；H)10000rpm、4℃离心10min，吸干液体；I)沉淀用75％乙醇500μl漂洗二次；J)沉淀于室温或37℃以下恒温箱中干燥片刻至刚开始出现半透明状，勿过度干燥；K)加入100-200μl灭菌重蒸水溶解DNA，可于65℃水浴助溶；L)取2-5μlDNA，加1μl6×上样缓冲液混匀，以λHindIIIDNAmarker作为分子量标准，在1×TAE缓冲液中于120V进行琼脂糖凝胶电泳30min，EB染色5-10min后，于紫外成像仪中拍照，检查DNA的质量；M)100-500倍稀释DNA，于快速核酸蛋白分析仪上测定OD260及OD280，根据OD260计算DNA的浓度，并以OD260/OD280的大小确定DNA的质量；N)保存DNA于-20℃。实验二从植物基因组DNA扩增并回收特异基因片段一、实验目的PCR（聚合酶链式反应）是现代分子生物学和基因工程的基本技术手段，用途广泛，在采用了可耐高温的TaqDNA聚合酶并保证了模板DNA、引物对、dNTP、Mg2+、buffer等反应条件后，PCR仪可以自动按照反应程序指导模板DNA上与一对引物互补配对的区段间一段特定DNA片段的扩增，产物可用于基因克隆、分子标记多态性分析等多种用途。二、基本原理首先，模板DNA在94℃高温下变性成单链，降温退火过程中一对引物分别与两条模板单链的对应区段发生互补性结合即退火，在72℃条件下时TaqDNA聚合酶催化引物引导的5’→3’方向的新链DNA的合成即延伸。延伸的产物又可作为下一次循环反应的模板，用于指导下一级DNA新链的合成，如此多次循环，导致原有模板中的特异DNA片段发生几乎为指数级的增加。由于特异引物PCR中引物的核苷酸序列是根据分子生物学实用技术（S219）实验操作教程西南大学农学与生命科学学院柴友荣研究员3与待扩增片段的两端序列而设计的，故扩增产物就是该待扩增片段的拷贝。CHSA（查尔酮合酶A）是甘蓝型油菜类黄酮、花青素、多酚和单宁合成途径的一个关键酶，本实验采用植物CHSA基因引物，从甘蓝型油菜基因组DNA中扩增CHSA基因片段，并完成目的片段的琼脂糖凝胶回收，以达到熟悉PCR扩增与产物回收基本操作技能的目的。三、实验材料甘蓝型油菜(BrassicanapusL.)基因组DNA（上一实验中自已抽提并贮存于－20℃的DNA），CHSA基因引物对FCHSA/RCHS（10μmol/L）。四、主要仪器设备及耗材MyCyclerPCR仪，EppendorfMinispin离心机，SanyoSIM-F124制冰机，TOMYSS-325自动灭菌锅，MilliporeElix纯水系统，Eppendorfresearch微量移液器系列，HH·S21-4-S恒温水浴锅，UVPGDS8000自动高效紫外透视成像仪，宾达UV-IV型紫外分析仪，DYY-8C型双稳定时电泳仪及水平电泳槽，GenespecI快速核酸蛋白自动分析仪，GingTianJA2003A电子天平，SatoriusPB-10pH计，长岭BCD-239家用冰箱，微波炉，手掌离心机，离心管（1.5ml、0.2ml），枪头（10、200和1000μl），两面板，枪头盒，离心管盒（1.5ml）等。五、主要试剂（盒）：TaqDNA聚合酶及氯化镁、PCRbuffer，dNTP（10mmol/L），重蒸水，单蒸水，矿物油，琼脂糖，6×上样缓冲液，DL2000DNAmarker，EB溶液（0.25μg/ml），1×TAE缓冲液，胶回收（小量）试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）。六、实验步骤（一）、PCR扩增与检测在一个0.2ml的离心管（PCR管）中配置一个50µl的PCR反应体系，其中包括：ddH2O37.5µl10×PCRbuffer5µl25mmol/LMgCl23µl10mmol/LdNTP1µl10µmol/LFCHSA1µl10µmol/LRCHS1µl甘蓝型油菜基因组DNA1µl（基因组DNA应自然解冻，最好不要手温解冻）TaqDNA聚合酶（5U/µl）0.5µl（用冰盒取放Taq酶，不得用手接触酶液部）——————————————————————————总体积50µl混匀后用手掌离心机收集液体于管底，沿管壁加入20µl矿物油，再用手掌离心机收集液体于管底，PCR管停于冰上，设置好下列PCR反应程序后进行PCR扩增：94℃，4min（预变性）30个扩增循环：94℃，1min（变性）56℃，1min（退火）72℃，1min30sec（延伸）72℃，10min（继续延伸及产物末端加A）4℃，5min。取出PCR管，置于4℃冰箱。向150ml三角瓶中加入琼酯糖0.5g和1×TAEbuffer50ml，用微波炉化胶，混匀后倒于平放的制胶槽中，加18齿梳子，消除气泡，约30分钟后凝固，小心取出梳子。取25µlPCR产物加5µl上样缓冲液后混匀，然后均分上样于2个相邻胶孔，在样品孔旁的1个胶孔中点样DL2000Marker5µl，凝胶于1×TAEbuffer中电泳约30分钟，至溴酚蓝迁移至一半的距离时，取出凝胶于EB溶液中染色10分钟左右，然后于紫外成像仪中拍照。如果PCR扩增成功，应当有一条清晰的1287bp的DNA条带。（二）、PCR片段的凝胶回收与检测分子生物学实用技术（S219）实验操作教程西南大学农学与生命科学学院柴友荣研究员4A)用刀片从凝胶中切下目的DNA条带于一个事先称重的1.5ml离心管中，在保持条带完整性的前提下使胶块越小越好；B)称取凝胶重量，按每100mg凝胶300µl的量加入S1溶液，100mg以下的凝胶加300µlS1；C)50℃化胶10min，中途振荡混匀；D)加入三分之一S1体积的异丙醇，混匀后上至离心柱中；E)4000rpm室温离心30sec，弃废液；F)10000rpm室温干甩柱子15sec；G)向柱中加入500µlW1液，10000rpm室温离心15sec，弃废液；H)向柱中加入500µlW1液，静置1min，10000rpm室温离心15sec，弃废液；I)10000rpm室温干甩柱子1min；J)将柱子转入1个新的1.5ml灭菌离心管中，在柱中央加入30µlT1溶液；K)50℃水浴柱子3min；L)趁热于13400rpm室温离心1min，弃柱子；M)取5µl回收产物加1µl上样buffer，用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测（以DL2000为marker）；N)取1-5µl剩下的回收产物在蛋白核酸快速测定仪或分光光度计上测定回收产物的浓度；O)剩下的回收产物于-20℃冻存。实验三大肠杆菌感受态细胞制备、转化对照质粒以检测感受性一、实验目的大肠杆菌培养、感受态制备、感受性评价是