双腔搅拌式生物反应器提高β-磷酸三钙修复关节软骨缺损的效果

中国组织工程研究第18卷第3期2014–01–15出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchJanuary15,2014Vol.18,No.3ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH377黎健伟，男，1979年生，广西壮族自治区南宁市人，汉族，2009年南方医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事骨与软骨组织工程研究。通讯作者：黎健伟，主治医师，南方医科大学南方医院创伤骨科，广东省广州市510515doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2014.03.008[]中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2014)03-00377-06稿件接受：2013-10-30LiJian-wei,M.D.,Attendingphysician,DepartmentofOrthopedicsandTraumatology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,GuangdongProvince,[e-mail]:LiJian-wei,DepartmentofOrthopedicsandTraumatology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,GuangdongProvince,ChinaAccepted:2013-10-30双腔搅拌式生物反应器提高β-磷酸三钙修复关节软骨缺损的效果黎健伟1，赵辉1，张晓强2，王磊1，夏立恒1，金丹1，王钢1，余斌1(1南方医科大学南方医院创伤骨科，广东省广州市510515；2洛阳市正骨医院骨科，河南省洛阳市471000)文章亮点：实验的特色在于将实验室自行研发的一种可进行成骨及成软骨双向诱导分化的双腔搅拌式生物反应器应用于组织工程研究。与以往的搅拌式生物反应器相比，此生物反应器在提供应力刺激的同时可以对一块组织工程支架进行成骨和成软骨双相诱导，显著提高了工程化骨与软骨复合体的构建效率，提高了关节软骨缺损的修复效果。关键词：生物材料；软骨生物材料；组织工程；骨髓间充质干细胞；β-磷酸三钙；生物反应器；骨软骨；山羊主题词：生物相容性材料；组织工程；生物反应器；干细胞；复合体基金资助：广东高校优秀青年创新人才培养计划项目(育苗工程LYM11041)摘要背景：前期实验自行研发了一种可进行成骨及成软骨双向诱导分化的双腔搅拌式生物反应器。目的：探索双腔搅拌式生物反应器的力学刺激能否提高组织工程骨软骨修复山羊膝关节缺损的效果。方法：取青山羊12只，制作双侧后肢股骨内髁骨软骨缺损，随机分组，实验组与对照组缺损处均植入在双腔搅拌式生物反应器中进行成软骨、成骨诱导2周的自体骨髓间充质干细胞与β-磷酸三钙复合体，不同的是实验组将双腔搅拌式生物反应器置于磁力搅拌仪上给予力学刺激，对照组未给予力学刺激；空白对照组不做处置。植入后12，24周进行大体观察，Masson染色、Ⅱ型胶原免疫组织化学染色和组织学评分。结果与结论：实验组与对照组均有新生软骨与骨组织生成，实验组修复骨缺损效果明显优于对照组(P0.05)；空白对照组无新生软骨生成。表明通过双腔搅拌式生物反应器体外培养阶段的力学刺激，可以改善以山羊骨髓间充质干细胞为种子细胞、β-磷酸三钙为支架的组织工程骨软骨复合物对膝关节缺损的修复效果。黎健伟，赵辉，张晓强，王磊，夏立恒，金丹，王钢，余斌.双腔搅拌式生物反应器提高β-磷酸三钙修复关节软骨缺损的效果[J].中国组织工程研究，2014，18(3):377-382.Double-chamberstirredbioreactorimprovestherepairedeffectofbeta-tricalciumphosphateongoatkneecartilagedefectsLiJian-wei1,ZhaoHui1,ZhangXiao-qiang2,WangLei1,XiaLi-heng1,JinDan1,WangGang1,YuBin1(1DepartmentofOrthopedicsandTraumatology,NanfangHospital,SouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515,GuangdongProvince,China;2DepartmentofOrthopedics,LuoyangOrthopedic-TraumatologicalHospital,Luoyang471000,HenanProvince,China)AbstractBACKGROUND:Apreliminaryexperimentdevelopedadouble-chamberstirredbioreactorwhichcancarryoutosteogenicandcartilageinductionatthesametime.OBJECTIVE:Toexploretheeffectsofdouble-chamberstirredbioreactorontherepairofgoatkneecartilagedefectswithtissue-engineeredcartilage.METHODS:Twelvegoatswereselectedtomakebilateralfemoralcondyleosteochondraldefectsmodelsandrandomizedtothreegroups:experimentalgroup,implantedwiththecompositesofβ-tricalciumphosphateandbonemarrowmesenchymalstemcellsthatweresubjectedto2-weekchondrogenicandosteogenicinductionsimultaneouslyinthedouble-chamberstirredbioreactorundermechanicalstimulation;controlgroup,implantedwiththecompositesofβ-tricalciumphosphateandbonemarrowmesenchymalstemcellsthatweresubjectedto2-weekchondrogenicandosteogenicinductionsimultaneouslyinthedouble-chamberstirredbioreactor;blankcontrolgroup,withouttreatment.After12and24weeksofimplantation,generalobservation,Massonstaining,IIcollagenimmunohistochemicalstainingandhistologicalscoringwereperformed.RESULTSANDCONCLUSION:Intheexperimentalandcontrolgroups,newcartilagetissueandbonetissuewerevisible,buttheexperimentalgroupshowedbetterrepaireffectsthanthecontrolgroup(P0.05).Theblankcontrolgrouphadnocartilageformation.Thesefindingsindicatethatunderthemechanicalstimulationbythedouble-chamberstirredbioreactorinvitro,therepaireffectoftissue-engineeredosteochondralcomplexonkneejointcartilagedefectscanbeimproved.黎健伟，等.双腔搅拌式生物反应器提高β-磷酸三钙修复关节软骨缺损的效果P.O.Box10002,Shenyang110180:FoundationforDistinguishedYoungTalentsinHigherEducationofGuangdongProvince,No.LYM11041LiJW,ZhaoH,ZhangXQ,WangL,XiaLH,JinD,WangG,YuB.Double-chamberstirredbioreactorimprovestherepairedeffectofbeta-tricalciumphosphateongoatkneecartilagedefects.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2014;18(3):377-382.0引言Introduction创伤和各种疾病引起的关节骨软骨损伤在临床上十分常见，但是由于关节软骨其自我修复能力低下，当合并软骨下骨缺损时，因为失去了下方的骨支撑，软骨面的应力分布异常就难以避免，最终会导致骨性关节炎甚至骨性强直[1]。目前临床治疗多采用的软骨修复技术包括骨髓刺激和移植，但疗效均不理想[2-3]。骨软骨复合构建不仅能够提供软骨和软骨下骨的良好结合，还可以避免发生供区损伤等优势，已经成为目前组织工程研究的热点[4]。生物反应器动态培养可通过改善局部微环境促进干细胞增殖和分化[5]，其中，搅拌式生物反应器通过带动培养液流动产生的剪切力，可促进细胞的新陈代谢速率，有利于细胞获得更多的营养物质，促进细胞增殖及维持细胞正常形态，因而被广泛应用于组织工程领域[6]。骨髓间充质干细胞具有多向分化能力，可向成骨和成软骨方向分化。骨软骨复合体构建的目的是构建有软骨下骨支撑的工程化软骨，如果可以对一块组织材料同时进行成软骨和成软骨诱导，将会显著提高工程化骨与软骨复合体的构建效率。因此实验室自行研发了一种可进行成骨及成软骨双向诱导分化的双腔搅拌式生物反应器，以应用于组织工程研究。实验以山羊骨髓间充质干细胞作为种子细胞、β-磷酸三钙为支架材料构建组织工程化骨软骨复合体，然后在反应器中培养2周后植入山羊膝关节骨软骨缺损处，观察反应器提供的力学刺激能否提高关节软骨缺损的修复效果。1材料和方法Materialsandmethods设计：随机对照动物实验。时间及地点：于2012年6月至2013年4月在广东省骨与软骨再生医学研究重点实验室完成。材料：实验动物：10月龄雄性中国青山羊12只，体质量24-32kg，购于南方医科大学实验动物中心，随机分为实验组、对照组及空白组，每组4只。实验中对动物的操作符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》[7]。双腔搅拌式生物反应器：反应器是作者所在实验室自行设计，交玻璃仪器厂制作完成的，此双腔搅拌式生物反应器在提供应力刺激的同时可以对一块组织工程支架进行成骨和成软骨双相诱导。实验方法：山羊自体骨髓间充质干细胞的分离及培养：穿刺部位经利多卡因局部浸润麻醉，髂骨穿刺抽取实验组与对照组山羊骨髓10mL，置于含肝素的DMEM培养基中，180×g离心10min，吸取上清液，将沉淀接种于25cm2培养瓶[8]。每3d换液1次并于倒置相差显微镜下观察细胞生长状态，当细胞约80%融合后，按1∶3比例进行传代扩大至第3代，采用流式细胞术对细胞进行鉴定。在双腔搅拌式生物反应器内构建骨软骨复合体：β-磷