力生长因子促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化

中国组织工程研究第20卷第32期2016–08–05出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchAugust5,2016Vol.20,No.32ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4717·研究原著·佟雁翔，男，1981年生，河北省人，汉族，2015年重庆医科大学毕业，博士，主治医师，主要从事创伤骨科学、髋部骨折、骨盆环损伤以及骨组织工程研究。通讯作者：冯卫，博士，主任医师，内蒙古医科大学第二附属医院，内蒙古自治区呼和浩特市010059中图分类号:R394.2文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)32-04717-08稿件接受：2016-05-19力生长因子促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化佟雁翔1，冯卫1，贾燕飞1，王彩霞1，吕慧成1，吴一民1，蒋电明2(1内蒙古医科大学第二附属医院，内蒙古自治区呼和浩特市010059；2重庆医科大学第一附属医院，重庆市400993)引用本文：佟雁翔，冯卫，贾燕飞，王彩霞，吕慧成，吴一民，蒋电明.力生长因子促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化[J].中国组织工程研究，2016，20(32):4717-4724.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.32.001ORCID:0000-0002-5751-2803(佟雁翔)文章快速阅读：文题释义：力生长因子：来源于胰岛素样生长因子的一个亚型，它存在于受到牵拉刺激的肌肉中，且是非肝脏型的胰岛素样生长因子1。由于其在受到机械刺激时才产生的因子，力生长因子具有使肌肉卫星细胞激活和使肌原细胞生长的功能。同时力生长因子可以修复肌损失、治疗神经损伤并对心肌损伤有预防作用。反映成骨细胞活动的标志物：①碱性磷酸酶和骨碱性磷酸酶：自1923年Robinson发现碱性磷酸酶以来，碱性磷酸酶已作为评价骨形成和骨转换的重要指标，在骨形成过程中，成骨细胞活动增强，大量分泌骨碱性磷酸酶，骨碱性磷酸酶作为碱性磷酸酶的同功酶，特异性来源于骨组织，能反映成骨细胞活性；②骨钙蛋白：又称骨钙素，是在骨基质矿化过程中由成骨细胞合成的非胶原蛋白，是反映成骨活动和骨转换的重要标志，占骨组织非胶原蛋白10%-20%；③骨形态发生蛋白：主要生物学作用就是诱导间充质细胞分化为成骨细胞，进而产生新骨。摘要背景：力生长因子具有激活肌肉卫星细胞和促进肌原细胞生长的作用，同时在维持骨质量和修复骨损伤方面具有作用。目的：研究力生长因子促进兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的作用机制。方法：采用MTT法检测力生长因子促进兔骨髓间充质干细胞成骨分化的最佳质量浓度与时间。用定量PCR和Westernblot检测此质量浓度力生长因子促进兔骨髓间充质干细胞成骨分化后细胞中成骨细胞标志物碱性磷酸酶和骨钙素mRNA和蛋白的表达水平变化，并用WesternBlot检测AKT和mTOR磷酸化水平变化。结果与结论：力生长因子的质量浓度为45μg/L时作用5d促进兔骨髓间充质干细胞成骨分化的效果最好。45μg/L力生长因子促进兔骨髓间充质干细胞成骨分化后细胞中碱性磷酸酶和骨钙素mRNA和蛋白水平在干预后4h最高，同时AKT和mTOR的磷酸化水平也在干预后4h时最高。说明力生长因子促进兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化的作用机制是通过PI3K/AKT途径实现的，且在45μg/L干预后4h时的效果最好。关键词：干细胞；骨髓干细胞；力生长因子；PI3K/AKT通路；细胞分化；成骨细胞；mTOR力生长因子促进骨髓间充质干细胞的增殖及成骨分化力生长因子兔骨髓间充质干细胞MTT兔骨髓间充质干细胞定量PCR和Westernblot检测不同时间碱性磷酸酶和骨钙素mRNA和蛋白的表达Westernblot检测不同时间PI3K/AKT途径的蛋白的磷酸化情况力生长因子对兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化的作用机制45μg/L最佳力生长因子浓度佟雁翔，等.力生长因子促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化P.O.Box10002,Shenyang110180:FengWei,M.D.,Chiefphysician,SecondAffiliatedHospital,InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010059,InnerMongoliaAutonomousRegion,China主题词：细胞分化；碱性磷酸酶；组织工程MechanogrowthfactorpromotesthedifferentiationofbonemarrowmesenchymalstemcellsintoosteoblastsTongYan-xiang1,FengWei1,JiaYan-fei1,WangCai-xia1,LvHui-cheng1,WuYi-min1,JiangDian-ming2(1SecondAffiliatedHospital,InnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010059,InnerMongoliaAutonomousRegion,China;2theFirstAffiliatedHospitalofMedicalUniversityofChongqing,Chongqing400993,China)AbstractBACKGROUND:Mechanogrowthfactorhasthepotentialtoactivatemusclesatellitecellsandpromotemyogeniccellgrowth,andhasdualrolesinmaintainingbonemassandrepairingbonedefects.OBJECTIVE:Toexplorethemechanismunderlyingosteogenicdifferentiationofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcellspromotedbythemechanogrowthfactor.METHODS:ThebestconcentrationandtimeofmechanogrowthfactortopromoteosteogenicdifferentiationofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcellsweredetectedbyMTT.ThemRNAandproteinexpressionsofalkalinephosphataseandosteocalcinweredetectedbyqPCRandwesternblot,respectively.ThephosphorylationlevelofAKTandmTORweredetectedbywesternblotassay.RESULTSANDCONCLUSION:Thebestconcentrationandtimeofmechanogrowthfactorwas45μg/Land5daysforpromotingtheosteogenicdifferentiationofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcells.TheexpressionsofalkalinephosphataseandosteocalcinatmRNAandproteinlevelswerehighestafter4-hourinterventionwith45μg/Lmechanogrowthfactor,andmeanwhile,thephosphorylationlevelsofmTORandAKTwerealsohighest.ThesefindingsindicatethatthemechanogrowthfactorcanpromotethedifferentiationofrabbitbonemarrowmesenchymalstemcellsintoosteoblastsviaPI3K/AKTpathway,anditsbestconcentrationandtimeare45μg/Land4hours,respectively.Subjectheadings:CellDifferentiation;AlkalinePhosphatase;TissueEngineeringCitethisarticle:TongYX,FengW,JiaYF,WangCX,LvHC,WuYM,JiangDM.Mechanogrowthfactorpromotesthedifferentiationofbonemarrowmesenchymalstemcellsintoosteoblasts.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(32):4717-4724.0引言Introduction研究表明力生长因子具有激活肌肉卫星细胞和促进肌原细胞生长的作用[1-2]，还可以修复肌损失，治疗神经损伤，并对心肌损伤有预防作用[3]，表明力生长因子在维持骨质量和修复骨损伤方面具有作用[2，4]。研究表明力生长因子可以促进成骨细胞的增殖和分化[5-7]，其中主要表现在对成骨细胞和体骨形成中的明显作用[8]。PI3K/AKT信号通路在细胞的生长、分化、凋亡等方面都发挥着重要作用[9-11]。实验通过MTT选出最佳力生长因子促进骨髓间充质干细胞增殖的质量浓度，进而观察力生长因子对兔骨髓间充质干细胞中PI3K/AKT通路的作用，为进一步研究力生长因子的作用机制奠定基础。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计随机对照细胞学实验。1.2时间及地点实验于2014年12月在内蒙古医科大学完成。1.3材料健康清洁级新西兰大白兔，体质量1.5-3.0kg，购自上海市松联实验动物场，许可证号：SCXK(2007-0016)。1.4方法1.4.1骨髓间充质干细胞的分离与培养将新西兰大白兔以氯胺酮(0.5mg/kg)腹腔注射麻醉，备皮、消毒，取双侧大腿外侧切口，无菌条件下立即离断髋关节和膝关节，摘取股骨，小心剔除股骨上附着的软组织。剪断股骨两端，暴露骨髓腔，用含有双抗(青霉素1×105U/L、链霉素1×105U/L)的L-DNEM培养基冲出骨髓于离心管中，吹打制成单细胞悬液。将上述液体离心5min，1000r/min，弃上清。用含体积分数10%的胎牛血清、1×105U/L青霉素、1×105U/L链霉素的L-DMEM培养基重悬。将细胞接种于培养瓶中，置于37℃、体积分数5%CO2培养箱中培养。3d后进行半量换液，5d后全量换液，以后每3d换液一次。通过免疫荧光检测CD44和CD34的方法鉴定骨髓间充质干细胞。佟雁翔，等.力生长因子促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞的分化ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4719代兔骨髓间充质干细胞作为种子细胞，加于96孔板中，每孔100μL，接种细胞浓度为1×108L-1左右。加好后加盖，光学显微镜下观察每孔细胞的密度是否均匀，放入培养箱中培养。细胞贴壁且覆盖孔底90%以上时换液一次。加入终质量浓度分别为0，15，30，45，60和75μg/L力生长因子，分别作用1-10d，每个质量浓度做5个复孔。每孔中加入10μLMTT，培养4h。去上清，每孔加入100μLDMSO，在振荡器上震荡30min。