大肠杆菌工程菌发酵工艺中诱导条件的研究pdf

第20卷第2期四川文理学院学报2010年03月Vol.20No.2SichuanUniversityofArtsandScienceJournalMar.2010大肠杆菌工程菌发酵工艺中诱导条件的研究王晓洲,刘丹(四川文理学院化学与化学工程系,四川达州635000)摘要:通过比较在分批发酵中分别加入诱导剂IPTG0.3mM和0.5mM与诱导时间为3h和4h的不同组合,观察其对重组蛋白表达的影响,从而筛选出目的蛋白高效表达的最佳条件.实验表明,工程菌在对数生长的中后期(OD600为4)时添加终浓度为0.5mM的IPTG诱导对蛋白的表达最为有利.关键词:发酵;IPTG;诱导;目的蛋白中图分类号:O6-3文献标志码:A文章编号:1674-5248(2010)02-0046-03大肠杆菌是基因工程中常用的宿主菌,许多有价值的多肽和蛋白在大肠杆菌中已成功地进行了表达,表达水平有些高达细胞总蛋白的30%以上.大肠杆菌作为外源基因表达的宿主,由于具有遗传背景清楚,目的基因表达水平高,技术操作、培养条件简单,抗污染能力强,大规模发酵经济等优点,倍受遗传工程专家重视,是目前应用最广泛,最成功的表达体系.[1-4]提高外源基因表达水平,就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段,以减轻宿主菌的负荷.常用的方法有温度诱导和药物诱导.IPTG为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷,是β-半乳糖苷酶底物的类似物,有很强的诱导力,在有IPTG诱导物存在的条件下,诱导物可与阻遏蛋白结合成复合物,而使阻遏蛋白构象发生改变,阻遏蛋白就不能再与O基因结合,从而促进基因表达.本实验采用IPTG诱导外源基因表达,研究不同浓度的IPTG与不同诱导时间的组合下,通过摇瓶培养和发酵罐分批发酵两种不同的发酵方式,观察其对目的蛋白的表达的影响.1材料和方法NaCl5g,溶于500mlH2O,NaOH调节pH7.0,2L三角瓶装,灭菌锅湿热高压灭菌121℃,20min,室温保存.TB培养基(发酵培养基):胰蛋白胨240g,酵母粉480g,甘油80g,消泡剂1ml,溶于H2O,定容至19L,B.Braun发酵罐在位灭菌121℃,15min.1.1.2试剂诱导剂:IPTG(干粉)1.5g,溶于灭菌TB30ml,100ml三角瓶装,随用随配制.AMP(氨苄青霉素):80万单位的溶于5mldH2O,配制成16万单位/ml.染色剂(考马斯亮蓝):乙醇5%考马斯亮蓝R-250(Bio-Rad或Pierce)乙酸10%H2O40%脱色剂:乙醇30%乙酸10%dH2O60%蛋白Maker1.2工程菌的培养方法1.2.1三角摇瓶培养原理:液体培养基,接上菌种后,在摇床振荡培养,一段时间后,菌密度增大,培养液变浑浊.优点:摇床可控制温度,晃动可增大培养液里的溶氧,1.1材料缩短培养时间.1.1.1菌种和培养基各取菌液0.2ml于微量离心管中,7000rpm,5min,去掉DG13工程菌由本实验室自行构建并保存.上清液,在沉淀加入50μl去离子水后混匀,加入等体积的LB培养基(种子培养基):胰蛋白胨5g,酵母粉2.5g,还原型上样Buffer,沸水中加热10min,进行SDS凝胶电泳.3收稿日期:2009-06-31基金项目:四川文理学院院级重点项目《共振瑞利散射光谱法在糖类分子识别的研究》(2008A05Z)作者简介:王晓洲(1976—),女,四川达州人。助理研究员,硕士,主要从事分析化学研究。46©1994-2010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.王晓洲,刘丹:大肠杆菌工程菌发酵工艺中诱导条件的研究2010年第2期1.2.2发酵罐分批培养原理:在一个发酵系统中一次性投入含有适量浓度营养成分发酵培养基于特定的温度下灭菌,冷却后接入微生物菌体或孢子,在一定温度、酸度和溶解氧条件下进行发酵,直至发酵结束.整个过程中除了空气进入和尾气排出,与外界没有任何物料交换,是一种非恒态的发酵过程.发酵过程中营养成分不断消耗,产物不断积累,微生物浓度升高且逐渐达到一个定值.在后期由于营养物质迅速消耗,加入代谢产物或有害代谢副产物的积累,细胞活力下降,部分细胞开始死亡,活细胞浓度不断下降,选择最佳时刻放罐,发酵结束.可观察到微生物的4个典型的生长时期,即延迟期、对数期、静止期和死亡期.[5]发酵记录表:表1样品DG13①诱导时间3h,IPTG浓度0.3mM14:00加入IPTG开始诱导.TimeOD600PO2%转速通气PHTemp罐压11:000.6329.1202156.0937℃0.112:002.2128.9380156.0237℃0.113:004.1117.9490156.3137℃0.114:007.1215.4490156.6837℃0.115:0013.4114.7490306.7437℃0.116:0015.3519.5490306.8737℃0.117:0018.2426.5490306.9137℃0.117:00收罐,于4℃层析柜保存.次日上午8:30开始离心,离心结束,得489g湿菌体.表2样品DG13②诱导时间3h,IPTG浓度0.5mM14:00加入IPTG开始诱导.TimeOD600PO2%转速通气PHTemp罐压11:000.6629.1202156.0937℃0.112:002.0828.9380156.0237℃0.113:004.0917.9490156.3137℃0.114:006.9815.4490156.6837℃0.115:0012.9220.7490306.5737℃0.116:0014.3619.5490306.8837℃0.117:0017.421.5490306.9137℃0.117:00收罐,于4℃层析柜保存.次日上午8:30开始离心,离心结束,得477g湿菌体.表3样品DG13③诱导时间4h,IPTG浓度0.3mM15:00加入IPTG开始诱导.TimeOD600PO2%转速通气PHTemp罐压11:000.6129.1202156.0937℃0.112:002.0528.9380156.0237℃0.113:004.0717.9490156.3137℃0.114:007.9815.4490156.6837℃0.115:009.8720.7490306.5737℃0.116:0014.3419.5490306.6837℃0.117:0018.5722.5490306.9137℃0.118:0020.226.2490307.0837℃0.118:00收罐,于4℃层析柜保存.次日上午8:30开始离心,离心结束,得510g湿菌体.表4样品DG13④诱导时间4h,IPTG浓度0.5mM15:00加入IPTG开始诱导.TimeOD600PO2%转速通气PHTemp罐压11:000.5929.1202156.0937℃0.112:002.0228.9380156.0237℃0.113:004.1217.9490156.3137℃0.114:008.0115.4490156.6837℃0.115:009.9220.7490306.5737℃0.116:0012.6719.5490306.7937℃0.117:0016.8720.5490306.9037℃0.118:0019.2121.2490307.0137℃0.118:00收罐,于4℃层析柜保存.次日上午8:30开始离心,离心结束,得492g湿菌体.1.3分析方法1.3.1有表达的蛋白分子量以蛋白MAKER作对照,找出分子量的范围.1.3.2表达量的测定由SDS-PAGE凝胶电泳检测,再用考马斯亮蓝染色,脱色后照相,用专业扫描仪扫描后通过计算机计算出目的蛋白含量.2结果与讨论2.1表达产物的总含量测定目的蛋白的分子量为39KDa,由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳图,可观察诱导后的全菌蛋白电泳图在MAKER的从上到下第3-4条带之间有明显的蛋白表达带,而诱导前的全菌蛋白电泳图中相应位置没有这条带.说明成功表达目的蛋白.目的蛋白的表达总量=菌体重量×目的蛋白含量47©1994-2010ChinaAcademicJournalElectronicPublishingHouse.Allrightsreserved.期王晓洲,刘丹:大肠杆菌工程菌发酵工艺中诱导条件的研究测定结果:质粒表达外源蛋白的总量可以达到全菌蛋白30%以上.这些质粒非常适于实验室小规模操作,但IPTG价格昂贵,编号目的蛋白含量菌体重量表达总量且具有一定毒性,不是用于大规模制备外源蛋白生产的最DG13①19.80%489g96.82好选择.[6]DG13②22.30%477g106.4由实验结果可以看出,诱导时间越早,目的蛋白含量DG13③18.20%510g92.82越高,菌体量越少.这是因为培养基中的营养有限,而发酵DG13④18.90%492g92.98罐分批发酵在发酵的过程中是不补充营养物质的,加入由上表:DG13②的目的蛋白表达量最高.IPTG后,培养基中的养分一部分用于合成目的蛋白,用于2.2不同诱导时间及诱导浓度的表达SDS-PAGE分析菌体生长的养分相应的减少,菌体的生长被抑制,所以越晚诱导,细菌可以吸收更多的养分,产生更多的菌体,目的以MAKER作为对照,其分子量从小到大分别为蛋白的表达相应减少.相反的,一定浓度范围内,IPTG诱116.0KDa,66.2KDa,45.0KDa,35.0KDa,25.0KDa,导浓度越高,目的蛋白的表达就越好,菌体重量就相对较18.4KDa,14.4KDa,可看出在蛋白分子量范围为45.0KDa少.～35.0KDa中,蛋白存在表达带,而目的蛋白的分子量为经过以上影响因素的优化,说明补料分批发酵虽然可39KDa,说明目的蛋白有表达,其中,DG13②的表达带较明以解决分批发酵中存在的营养不足的问题,但由于其工艺显,说明表达情况较好.复杂、成本高、易污染等原因,在菌密度要求不太高的情况2.3讨论下,分批发酵不失为一种理想的发酵方法.异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导启动子的参考文献:[1]陈车生,吴乾一,袁勤生,吴梧桐.诱导条件对重组入锰超氧化物歧化酶发酵的影响[J].华东理工大学学报(自然科学版),2008,(5):646-651.[2]田文标,邹全明,张卫军.大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位基因工程菌发酵工艺的研究[J].第三军医大学学报,2005,(2):115-119.[3]陈明,王周芳,夏黎明.固定化基因重组酵母发酵木糖产乙醇[J].浙江大学学报(工学版),2008,(2):290-294.[4]叶姣,陈长华,夏杰,付水林,杨雅琴.温度对重组大肠杆菌生长及外源蛋白表达的影响[J].华东理工大学学报,2002,(2):364-368.[5]谢建波,王炳英,李方红.夏玉米覆膜种植水分利用效率实验[J].内江师范学院学报,2008,(4):101-103.[6][美]J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔.分子克隆实验指南(第3版下册)[M].北京:北京科学出版社,2002:1228.[责任编辑邓杰]StudyonInductionConditioninFermentationofEscherichiaColiWANGXiao-zhou,LIUDan(ChemistryandChemicalEngineeringDepartmentofSASU,DazhouSichuan635000,China)Abstract:BycomparingthetwocounterpartgroupsofFed-batchfermentations,inwhichonegroupisjoinedintotherevulsantIPTG0.3mMandtheother0.5mMandinductiontimeofoneis3handtheoth