第八讲蛋白质分选与膜泡运输(1)

第八讲蛋白质分选与膜泡运输核糖体合成的蛋白质，合成之后必须准确无误地运送到细胞的各个部位，在进化过程中每种蛋白形成了一个明确的地址签（addresstarget),细胞通过对蛋白质地址签的识别进行运送，这就是蛋白质的分选第一节细胞内蛋白质的分选一、信号假说与蛋白质分选信号二、蛋白质分选转运的基本途径与类型三、蛋白质向线粒体、叶绿体和过氧化物酶体的分选一、信号假说与蛋白质分选信号信号序列的发现和证实●微粒体实验为什么有些核糖体合成蛋白质时不同内质网结合,有些正在合成蛋白质的核糖体要同内质网结合,并将合成的蛋白质插入内质网?对此,美国洛克菲勒大学的GünterBlobel、DavidSabatini和BernhardDobberstein等于1971年提出两点建议①分泌蛋白的N-端含有一段特别的信号序列(signalsequence),可将多肽和核糖体引导到ER膜上;②多肽通过ER膜上的水性通道进入ER的腔中,并推测多肽是在合成的同时转移的。1960年获得蒂宾根大学医学学位；1967年在威斯康星·麦迪逊大学获得肿瘤学博士学位；1967-1968进入了纽约市洛克菲勒大学细胞生物学实验室继续从事生物研究;1969-1973在洛克菲勒大学任助教；1973-76在洛克菲勒大学任副教授；1976-今在洛克菲勒大学任教授；1986-今兼任洛克菲勒大学霍华德-休斯医疗中心研究员。1971年，布洛贝尔对上面的问题提出了“信号假说”，是否细胞分泌出的蛋白质内有引导细胞穿膜的信号。这只是他提出的一种推断。1975年，布洛贝尔系统地阐明了这种信号是由特殊排列的氨基酸组成，蛋白质在分解和合成的过程中，会通过一个通路而穿过细胞器。不仅如此他还详细地研究理论，证明信号假说还适应植物、动物等细胞的普遍规律。1980年，布洛贝尔在研究中提出每个蛋白质内部都有指明其在细胞中正确位置的信息功能，氨基酸的顺序决定了一个蛋白质是否会穿过膜进入到另一个细胞器，或者移到细胞外。(GunterBlobel)在GeorgePalade用离心技术分离到有核糖体结合的微粒体,即发现膜结合核糖体(membrane-boundedribosome)之后,科学家推测:膜结合核糖体合成的蛋白质首先要进入内质网的腔,然后通过选择性的分泌过程输出到细胞外,而游离核糖体上合成的蛋白质则留在细胞内使用。为了研究内质网上合成的蛋白质是否进入了内质网的腔,ColvinRedman和DavidSabatini用分离的RER小泡(微粒体)进行无细胞系统的蛋白质合成,证明了膜结合核糖体上合成的蛋白质进入了微粒体的腔。乔治·埃米尔·帕拉德(Palade，GeorgeEmil，1912-)，罗马尼亚细胞生物学家。在细胞生物学方面的开拓性工作，他与比利时的克里斯汀•勒内•德•迪夫（ChristianRenédeDuve）和美国的艾伯特•克劳德（AlbertClaude）共同获得了1974年的诺贝尔生理学-医学奖。帕拉德的贡献包括对电子显微镜方法的发展，发现了核糖体（ribosome），以及对高尔基体（Golgiapparatus）的研究等。●信号序列存在的直接证据1972年,CésarMilstein和他的同事用无细胞系统研究免疫球蛋白(IgG)轻链合成时获得了信号序列存在的直接证据,证明Blobel等的建议是正确的。他们用分离纯化的核糖体在无细胞体系中用编码免疫球蛋白轻链的mRNA指导合成多肽,发现合成的多肽比分泌到细胞外的成熟的免疫球蛋白在N端有一段多出的肽链,它有20个氨基酸,他们推测,这段肽具有信号作用,使IgG得以通过粗面内质网并继而分泌到细胞外。加与不加RER小泡,产物不同当将分泌蛋白的mRNA在无细胞体系中进行翻译时,如果不加粗面内质网(微粒体),获得的翻译产物比从细胞中分泌出来的蛋白要长,若添加RER小泡,翻译的产物长度与从活细胞分泌的蛋白相同。因此推测信号序列在引导蛋白进入内质网后被切除了,所以成熟的蛋白的N-端没有信号序列(图9-16)。(a)在不含RER小泡的无细胞体系中翻译分泌蛋白,其N-端有信号序列,故比从细胞中分泌出来的相同蛋白质肽链长;(b)在加有RER小泡的无细胞体系中翻译分泌蛋白,信号序列在RER小泡中被切除,得到的产物与从细胞中合成分泌的相同。■信号序列的一般特征及早期信号假说G.Blobel、B.Dobberstein、P.Walter和他们的同事在研究中还发现信号序列具有一些共同的特性:长度一般为15～35个氨基酸残基,N-末端含有1个或多个带正电荷的氨基酸,其后是6～12个连续的疏水残基;在蛋白质合成中将核糖体引导到内质网,进入内质网后通常被切除(图9-17)。图9-17ER跨膜可切除信号的一般结构一些信号肽序列信号功能举例蛋白进入ER+H3N-Met-Met-Ser-Phe-Val-Ser-Leu-Ler-Leu-Val-Gly-Ile-Leu-Phe-Trp-Ala-Thr-Glu-Ala-Glu-Gln-Leu-Thr-Lys-Cys-Glu-Val-Phe-Gln-滞留在ER中-Lys-Asp-Glu-Leu-COO-蛋白进入线粒体+H3N-Met-Leu-Ser-Leu-Arg-Gln-Ser-Ile-Arg-Phe-Phe-Lys-Pro-Ala-Thr-Arg-Thr-Leu-Cys-Ser-Ser-Arg-Tyr-Leu-Leu-进入细胞核-Pro-Pro-Lys-Lys-Arg-Lys-Val-进入过氧化物酶体-Ser-Lys-Leu-●早期的信号假说1975年,G.Blobel和B.Dobberstein根据对信号序列的研究成果,正式提出了信号假说(signalhypothesis),要点是:(1)分泌蛋白的合成始于细胞质中的游离核糖体;(2)合成的N-端信号序列露出核糖体后,靠自由碰撞与内质网膜接触,然后靠N-端信号序列的疏水性插入内质网的膜;(3)蛋白质继续合成,并以袢环形式穿过内质网的膜;(4)如果合成的是分泌的蛋白,除了信号序列被信号肽酶切除外,全部进入内质网的腔,若是膜蛋白,则由一个或多个停止转移信号将蛋白质锚定在内质网膜上。●信号假说证明:基因重组实验信号假说提出后得到许多实验的支持,其中最有力的一项实验结果是杂合蛋白研究的结果。黑猩猩的α-球蛋白是一种在游离核糖体上合成并存在于胞质溶胶中的可溶性蛋白,科学家在编码该蛋白的基因上接上一段编码E.coli分泌蛋白β-半乳糖透性酶(β-lactamase)的信号序列DNA,然后将该基因加入到无细胞的转录和翻译体系中,并加入从狗组织中分离的ER膜,研究结果发现,杂合蛋白出现在ER腔中,而且信号序列被切除了。这一研究结果不仅证实了信号假说的正确性,也揭示了信号序列的一个重要特性:信号序列没有特异性,并且原核生物的信号序列在真核生物中也是有效的。■新蛋白复合物的发现与信号假说的补充●信号识别颗粒(signalrecognitionpartical,SRP1981年,发现了信号识别颗粒(signalrecognitionpartical,SRP),是一种核糖核酸蛋白复合体,沉降系数为11S，含有分子量为72kd、68kDa、54kDa、19kDa、14kDa及9kDa的6条多肽和一个7S(长约300个核苷酸)的rRNA(图9-18),SRP上有三个功能部位:翻译暂停结构域(P9/P14)、信号肽识别结合位点(P54)、SRP受体蛋白结合位点(P68/P72)。它的作用是识别信号序列,并将核糖体引导到内质网上.●停靠蛋白(dockingprotein,DP)即SRP在内质网膜上的受体蛋白,它能够与结合有信号序列的SRP牢牢地结合,使正在合成蛋白质的核糖体停靠到内质网上来。由TRAM蛋白和Sec61蛋白构成，可结合信号肽和停止转移序列，引导新生肽进入ER腔，在形成跨膜蛋白中有重要作用。●易位子(translocon)：●释放到内质网腔蛋白的合成（分泌蛋白和驻留蛋白）信号肽在游离核糖体上合成→信号肽与SRP结合→肽链延伸终止→SRP与DP结合→核糖体和ER膜上的核糖体受体结合→SRP脱离信号肽，被释放→肽链继续合成，信号肽开启ER膜上的易位子，引导新生肽链进入ER腔→信号肽被切除→肽链延伸至终止。分泌蛋白和跨膜蛋白的转运方式：+微粒体＋SRP＋DP产生含信号肽的完整多肽合成70～100aa后，肽链停止延伸信号肽切除，肽链进入微粒体ER腔中含切除信号肽的酶保留信号肽的蛋白游离核糖体+含编码信号序列的mRNASRP阻止蛋白合成DP可重新启动由SRP阻止的蛋白合成●跨膜蛋白形成跨膜蛋白：多肽链疏水性节段形成的α螺旋跨膜。内信号肽：位于多肽链内部的疏水性信号序列，内信号肽具有起始转移和终止转移信号功能。停止信号可以使易位子钝化，使多肽链转移停止，跨膜。停止转移序列：仅存在于跨膜蛋白上的一段aa序列，与内质网膜的亲合力很高，和易位子结合后阻止肽链继续进入网腔，是跨膜Pr的跨膜段。停止转移序列coo-coo-coo-coo-coo-NH3+NH3+NH3+NH3+NH3+内质网膜整合蛋白的拓扑学类型跨膜蛋白的方向性1）单次跨膜蛋白整合到ER膜的方式：单次跨膜蛋白有一个末端起始转移序列，一个停止转移序列，依靠停止转移序列跨膜。或只有一个中间转移信号序列,依靠其转移和跨膜。2）双次跨膜蛋白整合到ER膜的方式：一个中间开始转移序列，一个停止转移信号，依靠二者共同跨膜。3）多次跨膜蛋白整合到ER膜的方式：具有两个以上中间转移序列和停止转移序列，多肽链前后来回重复的通过脂双层。二、蛋白质分选转运的基本途径与类型核基因编码的蛋白质的分选途径：(1)后翻译转运途径(2)共翻译转运途径根据蛋白质分选的转运方式或机制不同，又可将蛋白质转运分为4类：三、蛋白质向线粒体、叶绿体和过氧化物酶体的分选转运到线粒体、叶绿体和过氧化物酶体等细胞器的蛋白质分选是一个多步过程，需要多个不同的靶向序列，定位到叶绿体的前体蛋白N端具有40-50个氨基酸组成的转运肽，用以指引多肽定位到叶绿体并进一步穿过叶绿体被摸进入到基质或类囊体中。转运到线粒体和过氧化物酶体的蛋白质与此类似，即靠的是N端的导肽或C端的靶向序列。蛋白质合成定位的特点：后转移方式转运前的状态：伸展的前体蛋白N端的蛋白质信号序列称导肽前体蛋白=成熟蛋白+导肽导肽的特点：1）多位于N端，约由20个氨基酸，富含精氨酸、带羟基的氨基酸。2）形成一个两性的α螺旋，带正电荷的亲水氨基酸和不带电荷的疏水氨基酸分别位于α的两侧。3）对转运的蛋白质无特异性的要求。1线粒体前体蛋白定位分选信号线粒体前体蛋白定位分选信号大致可以分为两类：可剪切的前导序列和非剪切的多种整合定位信号.信号序列定位转运装置信号序列位置位于N端，富含带正电荷的和疏水的氨基酸，形成两性α螺旋，完成转运后被切除。基质TOMTIM23不被切除，含疏水性的停止转移序列，被安插到外膜。外膜TOM被切除，含疏水性的停止转移序列，被安插到内膜。内膜TOMTIM23含两个信号序列，首先转运到基质，第一个信号序列被切除，第二个信号序列引导蛋白进入内膜或膜间隙。内膜膜间隙TOMTIM23结构类似于N端信号序列，但位于蛋白质内部。内膜TOMTIM23为线粒体代谢物的转运蛋白，如腺苷转位酶，具有多个内部信号序列和停止转移序列，形成多次跨膜蛋白。内膜TOMTIM22线粒体基质蛋白的定位分选信号为可剪切的前导序列.参与该运输途径的蛋白质分子机器主要有：TOM、TIM23和PAM复合体。负责转运内部具有信号序列的蛋白负责转运N端具有信号序列的蛋白负责TOM复合物的组装前体蛋白首先与外膜表面受体Tom20结合，然后转移至Tom22。在Tom5的协助下，前体蛋白以去折叠状态并以N端先通过的方式穿过TOM复合物的跨膜通道。在TIM23复合物亚基Tim23和Tim50的协同作用下[25]，出现在膜间隙侧的前体蛋白被牵引至TIM23复合物表面。在线粒体内膜膜电位和mtHsp70水解ATP提供的能量驱动下，前体蛋白穿过TIM23跨膜通道，并依次与Tim44和m