烟叶烘烤过程中碳氮代谢主要酶的测定

烟叶烘烤中淀粉酶活性测定1材料与方法1.1仪器设备J2-MC低温超速离心机，美国贝克曼公司；HC5-721型分光光度计，上海分析仪器总厂；BC1-数显电热恒温水浴锅，上海精密仪器公司。1.2试剂麦芽糖(Sigma)，3,5-二硝基水杨酸(Sigma)，牛血清蛋白(Sigma)，考马斯亮兰G-250(上海生工)，其他常规试剂。1.3淀粉酶粗酶液制备称取烘烤中烟样3g，于4℃放置的研钵中加少许石英砂研磨成匀浆，加少量蒸馏水，混匀，移入10ml离心管中，蒸馏水稀释至刻度，放置15~20min，每2~3min摇1次，然后置于离心机中以3000r/min离心15min，取上清液5ml置于15mL刻度试管中，定容、备用。2淀粉酶活性测定取10mL试管2支，1支作测试管，1支作对照管。测试管中加入1ml淀粉酶粗酶液和1mLpH5.6的柠檬酸缓冲液，于37℃水浴中预热15min；对照管中加入1ml淀粉酶粗酶液和1mlpH5.6的柠檬酸缓冲液，再加入4ml0.4mol/L的NaOH于37℃水浴中预热15min；然后在测试管和对照管中各加入2ml37℃预热的1%可溶性淀粉，准确反应10min后，在测试管中加入4ml0.4mol/L的NaOH终止酶活性。2.1麦芽糖标准曲线绘制及定量取15ml刻度试管6支，编号，依次加入浓度为0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5mg/mL的麦芽糖标准溶液2.0mL，再加入3,5-二硝基水杨酸溶液各2ml，沸水浴中准确煮沸5min，取出冷却，加入10ml蒸馏水，于525nm下比色，记录OD值，绘出1条0~0.5mg/ml的麦芽糖标准曲线。取15ml刻度试管3支，分别加入2.0ml蒸馏水、2.0ml对照管液和2.0ml测试管液，每管再加入3,5-二硝基水杨酸溶液2ml，沸水浴中准确煮沸5min，取出冷却，加入10ml蒸馏水，摇匀，于525nm下比色，记录OD值，根据标准曲线计算出麦芽糖浓度。2.1.2酶蛋白标准曲线绘制及定量取10ml干洁刻度试管6支，编号，依次加入浓度为0，40，80，120，160，200μg/ml的蛋白质标准溶液1.0ml，再向各管加入5ml考马斯亮兰G-250溶液，摇匀，静置2min，于595nm下比色，记录OD值，绘出1条0～200μg/ml的蛋白质标准曲线。取酶液1ml加入5ml考马斯亮兰G-250溶液，摇匀，静置2min，于595nm下比色,记录OD值，从标准曲线上计算出所含的酶蛋白量。酶活力(U)=(C测试管-C对照管)×V/t·m酶。式中：C测试管———测试管液麦芽糖浓度；C对照管———对照管液麦芽糖浓度；V———测试管或对照管液体积；t———反应时间；m酶———酶蛋白含量。1mg酶蛋白在37℃、pH5.6条件下，10min分解可溶性淀粉产生1mg麦芽糖为1个酶活性单位（1U）。