生物技术制药复习资料(考试版)

生物技术制药复习资料简述种子培养的原因。(1)斜面微生物的数量不足以形成生产规模。(2)菌体的繁殖与产物的形成，在培养基与培养条件上要求并不一致。试简述影响种子质量的因素。1、原材料的质量2、培养温度3、湿度4、通气与搅拌5、斜面冷藏时间:接种龄和接种量的概念。接种龄：指种子罐中培养的菌体开始移入下一级种子罐或发酵罐时的培养时间。接种量：移入种子的体积与接种后培养液的体积之比。简述配置微生物培养基的几个营养要素。（一）培养基组分应适合微生物的营养特点（目的明确）（二）营养物的浓度与比例应恰当（营养协调）（三）物理化学条件适宜（条件适宜）（四）根据培养目的选择原料及其来源（经济节约）简述迟效性和速效性氮源的概念。迟效氮源：氮以大分子蛋白质的形式存在，需降解成小分子肽和氨基酸后才能被利用，如豆饼、葵花饼、花生饼等。速效氮源：以蛋白质降解产物形式存在的有机氮源可以直接被菌体吸收利用，这种氮源叫做速效氮源。如；蛋白胨、牛肉膏、酵母膏。简述迟效性和速效性碳源的概念。所有的微生物都能利用葡萄糖（速效）微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类（迟效）试叙述发酵过程中的中间分析项目及如何通过对这些项目的控制达到优化发酵的目的。中间分析项目：（1）pH（2）排气氧、排气CO2和呼吸熵（3）糖含量（4）氨基氮和氨氮（5）菌浓度和菌形态（6）产物浓度pH的控制(1)、调节好基础料的pH基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.5~6.8（2)、在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等(3)、通过补料调节pH在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH(4)、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH提高溶氧的办法(1）降低菌的生长速率，限制菌对氧的大量消耗；（2）调整培养基中能增加呼吸强度的碳源成分如葡萄糖，降低呼吸强度；（3）降低培养温度，可得到较高的溶氧值。但采取降低温度的做法往往影响菌体的正常生长。发酵培养基一般选用利用快速和慢速利用的氮源组成混合氮源。当pH偏高而又需补氮时，可补加生理酸性物质硫酸铵,以达到提高氮含量和调节pH的双重目的。菌浓的控制：(a)调节培养基的营养基质浓度控制菌浓：使基础培养基的配比适当，以避免产生过高或过低的菌浓;（b)通过中间补料控制菌浓：当菌浓较低时，可补加部分氮源或磷酸盐);（c)必要时可向发酵罐中补无菌水，降低发酵液的菌体浓度：即可降低菌浓又可降低发酵液的粘度。如何通过对发酵过程中营养物质的控制达到发酵最优化的目的。营养物质对发酵的影响：影响微生物的生长和产物的合成（1）碳源及其浓度对发酵的影响：快速利用的碳源和缓慢利用的碳源（速效和迟效碳源）。（2）缓慢利用的碳源有利于延长产物的分泌期（3）补加糖类来控制碳源浓度控制影响因素即对营养物质的控制。发酵过程如何通过对pH的控制达到发酵产物产量最大化的目的。(1)、调节好基础料的pH基础料中若含有玉米浆，pH呈酸性，必须调节pH。若要控制消后pH在6.0，消前pH往往要调到6.5~6.8（2)、在基础料中加入维持pH的物质，如CaCO3，或具有缓冲能力的试剂，如磷酸缓冲液等(3)、通过补料调节pH在发酵过程中根据糖氮消耗需要进行补料。在补料与调pH没有矛盾时采用补料调pH(4)、当补料与调pH发生矛盾时，加酸碱调pH通过对发酵温度的控制达到发酵最优化的目的影响发酵温度变化的因素Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q显-Q辐射1）Q生物：微生物在生长过程中产生的热能。影响生物热的主要因素有：菌种的特性、菌体的生长阶段、营养物质的种类和浓度、菌体的呼吸强度。2）Q搅拌：搅拌器转动引起发酵液之间和发酵液与设备之间的摩擦所产生的热量。3）Q蒸发：空气进入发酵罐与发酵液广泛接触后，引起水分蒸发所吸收的热量。4）Q显：排气所带走的热量。5）Q辐射：发酵罐外壁和大气间的温度差异而使发酵液中的部分热量通过罐体向大气辐射的热量最佳发酵温度：即适合菌体的生长又适合代谢产物合成的温度。适合生长的不一定适合产物的合成，随菌种、培养基成分、培养条件和菌体生长阶段不同而不同。试叙述影响发酵过程氧气供应和需求的因素及如何改善之。影响供氧方面的因素（a）搅拌：（b）通气(空气流量）：空气、废气（c）发酵液的粘度：（d）微生物生长的影响：（e)泡沫的影响：影响需氧量的因素（a)微生物的种类和生长阶段：（b）培养基的组成：(c)培养液中溶解氧浓度CL的影响（d)培养条件的影响：(e)二氧化碳浓度的影响提高溶氧的办法(1）降低菌的生长速率，限制菌对氧的大量消耗；（2）调整培养基中能增加呼吸强度的碳源成分如葡萄糖，降低呼吸强度；（3）降低培养温度，可得到较高的溶氧值。但采取降低温度的做法往往影响菌体的正常生长。发酵过程如何消除泡沫。（1）调整培养基的成分，减少泡沫的产生（2）机械消沫（3）消沫剂消沫何为限制性内切酶?存在的生理意义?限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子上特定核苷酸序列，并进行切割的水解酶。限制性内切酶的生理功能：1、构成了细胞抵御外源入侵DNA的防御机制;2、提供了细菌种属间进行交叉繁殖的屏障，但又允许外源DNA有某些遗漏。聚合酶概念、种类及其共性系专司生物催化合成脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)的一类酶的统称。可分为以下几个类群:(1)依赖DNA的DNA聚合酶；(2)依赖RNA的DNA聚合酶；(3)依赖DNA的RNA聚合酶；(4)依赖RNA的RNA聚合酶。共性：1、需要引物和模板；2、不能起始新的DNA连，催化dNTP连续加到双链DNA分子引物链3′-OH端；3、不从引物模板上解离。taqDNA聚合酶和pfuDNA聚合酶的共同点及不同点TaqDNA聚合酶耐高热1、末端A,即粘性末端2、5’→3’外切核酸酶活性；3、有链置换的能力；4、无3’→5’外切核酸酶活性，无校对功能,易突变；Mg2+依赖酶。用途：1、DNA序列分析；2、应用于聚合酶连反应（PCR）,对DNA分子的特定序列体外扩增(产物为粘末端）；pfuDNA聚合酶（pfuDNAPolymerase）1、有DNA聚合酶活性2、没有逆转录活性3、有3′-5′方向的外切酶活性.产物为平末端4、但是这些聚合酶的产量比TaqDNA聚合酶低。常用作PCR高保真PCR原理及反应要点PCR基本原理:根据碱基配对原则利用DNA聚合酶催化和dNTP的参与，引物依赖于DNA模板特性引导DNA的合成。PCR反应要点：1）模板DNA模板：0.05-1µg，含单拷贝基因数3*105，2）DNA聚合酶TaqDNA聚合酶：耐高热，粘末端产物PfuDNA聚合酶：高保真酶。平末端产物3）缓冲系统：4）dNTP浓度：基因组文库基因组文库（genomicDNAlibrary）：是指将基因组DNA通过限制性内切酶部分酶解后所产生的基因组DNA片断随机同相应的载体重组、克隆，所产生的克隆群体代表了基因组DNA的所有序列，包括外显子和内含子序列。cDNA文库从真核细胞分离总RNA,纯化出mRNA,逆转录合成互补的DNA,再在聚合酶作用下合成cDNA第二条链,然后将双链cDNA插入到载体内,构建重组体,转入宿主菌,得到的克隆总和成为该类细胞的cDNA文库。克隆载体和表达载体的区别是否含有表达系统元件，即启动子--核糖体结合位点--克隆位点--转录终止信号，这是用来区别克隆载体和表达载体的标志。克隆载体被克隆的基因不一定会表达，但一定被大量复制。克隆载体三个要素：1）复制子：2）选择标记：3）多克隆位点：表达载体就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），是目的基因能够表达的载体。穿梭载体的特点及在基因工程操作中的意义穿梭载体(shuttlevector)是指含有两个亲缘关系不同的复制子，能在两种不同的生物中复制的。例如既能在原核生物中复制,又能在真核生物中复制的载体。这类载体不仅具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因，还有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状，具有多克隆位点。通常穿梭载体在细菌中用于克隆,扩增克隆的基因，在酵母菌中用于基因表达分析。影响DNA连接的因素1、DNA片段之间的连接方式。2、目的基因与载体的浓度和比例。3、连接温度、时间、连接酶的活性及缓冲体系。融合蛋白及非融合蛋白的概念融合蛋白表达的蛋白质或多肽的N末端由载体DNA编码，C末端由克隆的外源DNA编码非融合蛋白是指在大肠杆菌表达的蛋白以真核蛋白的mRNA的AUG为起始，其氨基端不含原核序列。影响目的基因在大肠杆菌中表达的因素1、外源基因的拷贝数2、外源基因的表达效率3、表达产物的稳定性4、细胞的代谢负荷5、工程菌的培养条件(1).外源基因的拷贝数1、载体拷贝数决定着外源基因的拷贝数2、外源基因克隆到高拷贝数质粒上→表达质粒拷贝数增加→外源基因拷贝数增加→基因表达产物增加.(2).外源基因的表达效率1、启动子的强弱2、核糖体结合位点的有效性3、SD序列和起始密码子的间距4、密码子的组成等(3).表达产物的稳定性1、组建融合基因，产生融合蛋白;2、把真核基因产物运输到胞浆周质的空隙中，或分泌至培养基中;3、采用位点特异性突变方法，改变真核蛋白二硫键的位置，从而增加蛋白的稳定性;4、选用蛋白酶缺陷型宿主菌，减弱表达产物的降解;5、共表达能提高特定目标蛋白的稳定性的辅助因子，如蛋白分子伴侣等。(4).细胞的代谢负荷影响：1、外源基因表达产物可能对宿主有毒性。2、大量的外源产物可能打破宿主细胞的生长平衡。3、宿主细胞的代谢受阻，反过来会影响外源基因的表达。采取的措施：1、细胞生长和外源基因的表达分为两个阶段：细胞生长期，外源基因表达期。2、细胞的生长与重组质粒的复制分开(5).工程菌的培养条件培养基的组成、温度、pH、培养时间基因工程蛋白药物常用的修饰方法。1、聚乙二醇化修饰2、糖基化修饰3、人血清白蛋白修饰4、用其他修饰剂修饰（1）用脂肪酸修饰（2）用糖肽修饰（3）用卵磷脂修饰抗体分子的基本结构及各部分的功能抗体单体由4条多肽链（2条相同的重链和2条相同的轻链）通过二硫键（-S-S-）连接而成，为“Y”字形结构。（一）V区的功能1.识别并特异性结合抗原：2.与毒素结合可以中和其毒性；3.与病原体结合，可以阻止其对机体细胞的黏附和感染。（二）C区的功能1.激活补体系统2.介导免疫细胞活性①抗体的调理作用；②ADCC作用；③介导超敏反应。3.穿过胎盘和黏膜多克隆抗体和单克隆抗体区别多克隆抗体：由于一个抗原通常都有几个抗原决定簇，因此每个免疫细胞都可能产生一种针对某一抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原产生的不同抗体统称为多克隆抗体。这些由不同B细胞克隆产生的抗体，称为多克隆抗体。单克隆抗体：单一类型的只针对某一抗原决定簇的抗体分子，是由单一的B淋巴细胞克隆产生的结构和特异性完全相同的高纯度抗体。试述利用HAT培养基选择杂交瘤细胞的原理原理是基于动物细胞融合技术得以实现的，即骨髓瘤细胞与B细胞的融合。双特异性抗体是含有两个不同配体结合位点的抗体分子。它有两个不同的抗原结合部位（两个臂），可分别结合两种不同的抗原表位。其中一个臂可与靶细胞表面抗原结合，另一个则可与效应物（如药物、效应细胞等）结合，从而将效应物直接导向靶组织细胞。改型抗体/人源化抗体CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。该抗体既具有鼠源性单抗的特异性又保持了人抗体的功能（C区的功能）。嵌合抗体是利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达的抗体，表达的抗体分子中轻链、重链的V区是异源的，而C区是人源的，即整个抗体分子的60%~70%是人源的。分离纯化酶的一般程序1、预处理：材料的选择，发酵液预处理和细胞破碎2、粗分级分离：又称初步纯化或提取。盐析，等电点沉淀，有机溶剂沉淀，萃取和离心分离3、细分级分离：又称高度纯化，即酶的精制。层析法（