第五章食品卫生细菌学检验技术

课题第五章食品卫生学检验技术§5-1食品卫生学检验总则§5-2食品卫生细菌学检验技术日期星期科长签字教学目的1知识：熟悉微生物检验的基本程序和要求。2技能：掌握食品微生物检验中常见检样的制备技术。3素质：通过学习，提高学生的学习兴趣、养成良好的学习自觉性。重点与难点重点：微生物检验的基本程序难点：食品微生物检验中常见检样的制备技术教学内容及过程方法与环节§5-1食品卫生学检验总则食品卫生细菌学检验的目的，是要对食品进行细菌卫生评价。这就要求检验人员在求实的精神下，科学地进行被检对象的采样、样品送检、检样处理、检验以及报告。在整个过程中，不得掺杂检验人员的丝毫主观臆想和工作上的马虎，要有章可依地进行检验和报告。样品的采样→送检→样品的处理→检验与报告一、样品的采集1、样品种类样品可分大样、中样、小样三种。大样是指一整批样品；中样是指从样品各部分取得的混合样品，定型包装及散装食品均采样及散装食品均采样250g；小样系指分析用的样品，又称为检样，检样一般为25g。2、采样的方法根据样品，如袋装、瓶装或罐装食品，应采用完整的未开封的样品；检样是冷冻食品，应保持冷冻状态（可放在冰内、冰箱的冰盒内或低温冰箱保存），非冷冻食品需在0～5℃中保存。（1）液体样品的采样：将样品充分混匀，无菌操作开启包装，用100ml无菌注射器抽取，放入无菌容器。（2）半固体样品的采样：无菌操作开启包装，用灭菌勺子从几个部位挖取样品，放入无菌容器。（3）固体样品的采样：大块整体食品应用无菌刀具和镊子从不同部位取样，应兼顾表面和深度，注意样品代表性；小块大包装食品应从不同部位的小块上切取样品，放入无菌容器。样品是固体粉末，应边取样边混合。（4）冷冻食品的采样：大包装小块冷冻食品的采样按小块个体采取；大块冷冻食品可以用无菌刀从不同部位削取样品或用无菌小手锯从冷冻上方法：1、启发法2、问答法3、演示法环节：1、讲授2、小结3、后记锯取样品，也可以用无菌钻头钻取碎样品，放入无菌容器。注：固体样品或冷冻食品取样还应注意检样目的，若需检验食品污染情况，可取表层样品；若需检验其品质情况，应再取深部样品。（5）生产工序监测采样车间用水：自来水样从车间各水龙头上采取冷却水，汤料从车间容器不同部位用100ml无菌注射器抽取。车间台面、用具及加工人员手的卫生监测：用板孔5cm2无菌采样板及5支无菌擦拭25cm2面积。车间空气采样：将5个直径90mm的普通营养琼脂平板分别置于车间的四角和中部，打开平皿盖5min，然后盖上平板送检3、采样的数量采样的标签：采样前或后应立即贴上标签，每件样品必须标记清楚，如品名、来源、数量、采样地点、采样人及采样时间（年、月、日）取样注意事项：（1）防止交叉污染或二次污染：取样人员的个人卫生控制；取样地点的环境控制，空气净化要达到要求；取样的器皿要求彻底消毒，避免直接与空气接触；取样的操作要规范、迅速（无菌操作）；减少样品存放的时间（保持样本原有的状态、易变质的样本要冷藏）(2)取样要有代表性：取样的数量标准；取样的方法采样所出的问题二、送检采样后，在送检过程中，要尽可能保持检样原有的物理和微生物状态，不要因送检过程而引起微生物的减少或增多。1、无菌方法采样后，所装样品的容器要无菌，装样后尽可能密封，以防止环境中的微生物进一步污染；2、进行微生物检验的样品，送达实验室要越快越好，一般不应超过3h。若路途遥远，可将不需冷冻的样品，保持在1～5℃环境中送检，可采用冰桶等装置；若需保持在冷冻状态（如已冰冻的样品），则需将样品保存在泡沫塑料隔热箱内，箱内可置干冰，使温度维持在0℃以下，或采用其他冷藏设备；3、送检样品不得加入任何防腐剂；4、水产品因含水分较多，体内酶的活力较旺盛，易于变质。因此，采样后应在3h内送检，在送检途中一般都应加冰保存；5、对于某些易死亡病原菌检验的样品，在运送过程中可采用运送培养基。6、检样标注适当的标记并填写微生物学检验特殊要求的送检申请单。其内容包括：样品的描述，采样者的姓名，采样的日期、时间、地点，采样时的温度和湿度等•三、样品处理••不同食品的处理方法••样品处理的问题四、检验与报告检验：检验样品送到实验室后，立即将样品置于普通冰箱或低温冰箱中，并进行登记、填写实验序号，按检样检样要求，积极准备条件进行检验。样品收集后应于36h内检验；报告：按样品项目完成各类检验后，检验人员应及时填写检验报告单，签名后送主管人员签字，加盖单位印章，以示生效，立即交食品卫生监督人员处理；实验室必须具有专用冰箱存放样品，对于一般阳性样品，在发出报告3天（特殊情况可适当延长）方可处理样品；进口食品的阳性样品，需保存6个月，才可处理；而对于阴性样品可及时处理。§5-2食品卫生细菌学检验技术1、肉与肉制品检样的制备2、乳与乳制品检样的制备3、蛋与蛋制品检样的制备4、水产品检样的制备5、饮料、冷冻饮品检样的制备6、调味料检样的制备7、糖果、糕点和蜜饯检样的制备8、酒类检样的制备9、方便面（速食米粉）检样的制备10、罐藏食品检样的制备小结：后记：课题第五章食品卫生学检验技术日期星期科长签字教学目的1知识：熟悉食品微生物检验中细菌总数和大肠菌群的检验程序。2技能：熟练掌握食品微生物检验中细菌总数和大肠菌群检测的操作技术、并能获得正确的检验结果，写出规范的检验报告。3素质：通过学习，提高学生的学习兴趣、养成良好的学习自觉性。重点与难点重点：食品微生物检验中细菌总数和大肠菌群的检验程序难点：食品微生物检验中细菌总数大肠菌群检测的操作技术、并能获得正确的检验结果教学内容及过程方法与环节§5-3食品卫生细菌学菌落总数的检验技术菌落总数的测定－－测定方法标准平板培养计数法（活菌计数法）显微镜直接计数法菌落总数快速检测纸片电阻抗法测定食品中细菌总数一、平板菌落计数法1、程序被检样品↓用生理盐水进行无菌稀释，做成几个适当稀释倍数的悬液↓选择2～3个适当稀释度悬液各1ml，加入无菌空培养皿内，每个稀释度做2～3个培养皿↓每个培养皿中倾注约1.5ml熔化并冷却到45℃左右的营养琼脂或肉汤琼脂培养基，冷却后，于37℃培养24↓菌落计数↓报告结果行动导向法1、学生课下查资料、做课件2、学生代表讲课件3、教师和学生提问、代表回答4、教师总结5、后记2、操作要点（1）将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基置于45℃恒温水浴锅中保温备用。（2）编号:无菌试管（10-1、10-2、10-3、10-4。。。。。）、无菌培养皿、空白对照平板（3）稀释菌液：（4）摇匀平板：平板前后、左右或者以顺时针、逆时针。（5）倒置培养3、菌落计数报告例次不同稀释度的平均菌落数菌落总平均数及报告方式（个/ml，或个/g）10-110-210-3两个稀释度菌落数之比1146817420－17400或1.7×1042多不可计29546460/295＝1.637750或3.8×1043多不可计27160600/271＝2.227100或2.7×1044多不可计1550511－511000或5.1×105528107－280或2.8×1026000－1×10或107多不可计30318－30300或或3.0×1044、菌落总数记录报告产品名称生产车间班次生产日期抽样日期检验日期细菌总数检验依据培养基接种营养琼脂培养基结果报告数（个/g或ml）AB平均数110-110-210-310-410-5空白备注检验员：日期：复核：日期：5、注意事项（1）检验中所用玻璃器皿，如培养皿，吸管、试管等必须是完全灭菌的，并在灭菌前彻底洗涤干净，不得残留有抑菌物质。（2）充气饮料应在无菌条件下进行排气；酸性样品用经过灭菌的20～30％碳酸钠溶液调整pH值至中性；高盐样品应用灭菌蒸馏水进行稀释。(3)在作10倍递增稀释中，吸管插入检样稀释液内不能低于液面2.5cm；吸入液体时，应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于玻璃瓶或试管的内壁使吸；当用吸管将检样稀释液加至另一装有9mL空白稀释液的试管内时，应小心沿管壁加入，不要触及管内稀释液，以防吸管尖端外侧部分粘附的检液也混入其中。(4)为了防止细菌增殖及产生片状菌落，在检液加入平皿后，应在20分钟内向皿内倾入琼脂，并立即使其与琼脂混和均匀。（5）计数表示方法：CFU/ml或个（国际标准6、其他菌落总数的测定1、平板菌落计数法测定的是在营养琼脂上生长发育的嗜中温性需氧或兼性厌氧的菌落总数。厌氧菌、嗜冷菌、嗜热菌在此条件下不生长，有特殊营养要求的一些细菌也受到了限制。3、嗜冷菌计数（新鲜鱼贝）操作要点：采样后尽快冷藏检验；稀释液涂布于TS或CVT琼脂平板上，平板倒置于冰箱中冷藏培养。4、嗜热菌操作要点：采样煮沸5min（杀死细菌繁殖体）；5、厌氧菌操作要点：稀释液与45℃硫乙醇酸钠琼脂混合摇匀，倒平板，在其上封一层3％无菌琼脂。7、出现的实际工作问题1、做菌落总数检测时,发现稀释倍数大的比稀释倍数小的平皿上生长的菌落数还多,而且空白对照又没长菌,我找不出啥原因？2、我做的菌落总数的测定，是把浓缩的复合芽孢杆菌进行10-8、10-9、10-10稀释，在涂布法吸取0.1ml的3个浓度的时候，培养皿中长出来的菌2个10-9长了一大片的菌连在一起，10-8也有一个这样，其他的几乎不长，究竟怎么会事？3、检测菌落总数时,有些菌落难以区别,有没有什么好的试剂,能增加菌落的可见率？4、我公司做的菌落总数和技术监督局所测的数目存在巨大差别.是这样的:我公司跟客户采购一批的鸡粉，多次检测此批产品菌落总数均在5000左右，超过我司的内控标准。但客户检测数目与我司不符，于是我司把产品送到当地的技术监督局检测，所得结论是菌落总数为：205个/克。所以我们老总怀疑我们的工作能力，但问题是在其中一次操作中，我们同时化验两种不同品牌的鸡精，一种不符合要求，一种可以。二、菌落总数快速检测纸片三、电阻抗法测定细菌总数原理：供细菌生长的液体培养基是电的良导体，在特制的测量管底部装入电极插头，即可对接种生长的培养基的阻抗变化进行检测。阻抗变化的产生是由于微生物生长过程中的新陈代谢使培养基中的大分子营养物质(糖、脂类、蛋白质等）被分解成小分子代谢物，即较小的带电离子（乳酸盐、醋酸盐、重碳酸或氨等）这些代谢产物的出现和聚集，增强了培养基的导电性能，从而降低了其阻抗值:M=(R0-RT)/R0×100%，其中R0表示开始时培养基的阻抗值，RT表示任意时刻培养基的阻抗值，M表示培养基电阻减少的百分数。电阻越小细菌活动越多，在一定范围内，菌落形成单位（CFU）的对数Log(CFU)与IDT（阻抗检测时间）呈直线关系。四、电阻抗法测定细菌总数优缺点：1、常规经典检测方法结果准确可靠，，但却存在繁琐、工作量大，好时过长；电阻抗法叫省力，样品细菌数在4～18小时内出结果。2、电阻抗法制作标准曲线过程中工作量较大，但以后的检测简便的多，不需要一系列稀释，只需样品1ml，培养基9ml，测量管一只。§5-4食品卫生大肠菌群的检验技术一、基本概念1、大肠菌群指一群37℃、24h能发酵乳糖，产酸，产气，需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便，以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量。3、大肠菌群包括大肠埃希氏菌（大肠杆菌）、柠檬酸杆菌、产气克雷白氏菌和阴沟肠杆菌等。大肠菌群的来源分粪便来源和非粪便来源，在44.5℃仍能生长的大肠菌群，称为粪大肠菌群，粪大肠菌群又叫耐热大肠菌群，在人和动物粪便中所占的比例较大，而且在自然界容易死亡。因此，粪大肠菌群对粪便污染的指示作用更为直接和贴切，主要就是大肠杆菌，但也包括克雷伯氏菌属，正是由于包括了克雷伯氏菌属，使其与粪便污染的相关性受到了影响。4、大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌这三个指标在实际工作中都在应用，但用途有所不同，一般认为大肠菌群是水源的卫生指标和食品加工卫生状况的通用指标，粪大肠菌群主要用于贝类和贝类养殖用水的卫生指标，大肠杆菌用于指示食品受到近期粪便污染或不卫生加工。5、大肠菌群表示方法：MPN（mostprobablenumber）/100mL二、乳糖发酵法