病毒学报告

犬瘟热防控研究成就与进展2011级生物科学20114083049张岳摘要：犬瘟热(Caninedistemper,CD)是由犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，流行范围广，发病率、致死率高，临床症状多样。CDV感染宿主广泛，所有日龄的犬都有可能感染。CDV属于副粘病毒科麻疹病毒属，有囊膜包裹的单股负链线性RNA病毒。CDV基因组编码6种蛋白，核衣壳（N）蛋白、磷（P）蛋白、基质膜（M）蛋白、融合（F）蛋白、血凝素（H）蛋白和大(L)蛋白。N、P和L蛋白与病毒复制有关；M蛋白与病毒的装配和出芽有关；F、H蛋白在病毒的侵染过程中起到关键作用。近年来，随着我国宠物业、毛皮经济养殖业的迅速发展，CD在我国的发病率有升高的趋势。论文对CDV分子生物学研究进展进行归纳总结。关键词：犬瘟热病毒，致病机理，分子生物学，致病机理，诊断检测，防御治疗犬瘟热(Caninedistemper,CD）是由犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)引起的一种急性、高度接触性传染病，流行范围广，发病率及致死率高。临床症状多表现为“双相热”，眼鼻有黏液样分泌物，伴有腹泻，严重时出现血便，四趾肉垫增厚、角质化明显，神经症状多表现为抽搐。CDV感染宿主广泛，主要为食肉目动物，如犬科、鼬科、浣熊科、猫科和灵猫科等，但主要宿主为犬科动物，所有日龄的犬都有可能感染［1］。本文将近期CDV分子生物学研究进行归纳总结，为深入研究提供参考。犬瘟热病毒的分子生物学CDV属于副黏病毒科麻疹病毒属，为有囊膜包裹的单股负链线性RNA病毒。呈圆形或椭圆形，有时呈长丝状。直径约为150nm，核衣壳呈螺旋对称。CDV只有１种血清型，根据血凝素(H)基因的多样性和病毒的毒力，分6种基因型(Asia1、Asia2、Europe、USA、Arctic和Vaccine）。由于具有囊膜，CDV对有机溶剂敏感，对酸碱抵抗力弱，所以临床上常用消毒方法即可杀灭；CDV对热和干燥敏感，故该病多流行于冬春寒冷季节。CDV侵染不同类型的细胞，如上皮、间质、神经内分泌和造血干细胞，在不同组织和器官内造成持续感染，例如中枢神经系统(CNS)和淋巴组织［2］。感染犬通常表现为呼吸道、胃肠道以及其他组织和器官的多种临床症状，其中急性感染导致中枢神经系统脱髓鞘性脑脊髓炎（demyelinatingleukoencephalomyelitis,DL）,并引起严重的全身免疫抑制和淋巴组织损耗［2-4］。基因组位于病毒粒子内部，被核衣壳蛋白包裹，基因组全长约16kb，基因组呈线性排列。从3’端至5’端的基因顺序依次为前导序列、N、P、M、F、H、L、前导（尾随）序列。3’端前导序列由55个核苷酸组成，5’端前导（尾随）序列由38个核苷酸组成。3’端前导序列和5’端前导（尾随）序列，被认为是启动、调节序列，指导基因的转录复制过程，同时又是CDV基因的转录终止、重起始序列。两序列之间包括6个非重叠基因区，编码六种基因蛋白：核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质膜蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素蛋白(H)、大蛋白(L)。N、P和L蛋白形成核糖核蛋白复合体(RNP)包裹病毒RNA，三种蛋白与病毒复制过程相关；两种表面糖蛋白F和H蛋白黏附在囊膜表面，形成纤突在病毒感染侵入过程中发挥重要作用；M蛋白则嵌合到囊膜内，在糖蛋白与核衣壳连接中起桥连作用，同时与病毒的装配和出芽有关。1、核衣壳(N)蛋白及其基因核衣壳(N)蛋白基因由1683个核苷酸组成，有一个开放阅读框起始于53位～55位的AUG起始密码子，共编码523个氨基酸，分子质量为58ku。N蛋白基因由中间保守区和N末端、C末端的可变区组成［5］。N蛋白具有较高的保守性，能诱导体液免疫和细胞免疫。N蛋白的C末端1aa～80aa、337aa～358aa为抗原识别不可或缺的抗原表位，能诱导体液免疫产生抗体［6］；N蛋白的9氨基酸寡肽(281aa～289aa，Tyr-Pro-Ala-Leu-His-Glu-Phe)介导CTL反应，可能是CTL活性细胞作用靶细胞的抗原表位之一，对CDV引起的细胞免疫具有重要作用［7-8］。N蛋白和P、L蛋白与复制过程相关，P和L蛋白具有RNA聚合酶活性，随后N蛋白包裹病毒RNA，避免RNA降解［9-10］，三者能够构成一个复制单位－核糖核蛋白复合体(RNP)。N蛋白上有特定的细胞核定位信号(NLS)和细胞核转出信号(NES)，NLS和NES为N蛋白核转运过程中所必需的［11］。YoshidaE等［6］通过间接免疫荧光实验(IFA)测得，缺失了N末端的1aa～80aa的N蛋白只在细胞质中发现，而缺失了C末端359aa～523aa的N蛋白分布在细胞质和细胞核中，证明N末端的1aa～80aa是N蛋白从胞质转运到核胞体所必需的。SatoH等［11］证明N蛋白的核定位信号(NLS)位于N末端高变区，在CDVN蛋白的N末端1aa～80aa，分别建立了8个氨基酸(2～15、16～23、24～32、33～42、43～52、53～61、62～71和72～80)残基缺失基因，经转染Cos-7细胞表达，根据N蛋白病毒粒子在细胞中表达的分布情况，发现CDVN蛋白N末端33aa～80aa对蛋白的细胞核转入起着重要的作用，继续对N末端33aa～81aa进行连续四个丙氨酸替换突变，IFA发现N(70～73)和N(74～77)核转运过程明显被破坏，验证了NLS位于N末端70aa～77aa，该区域是一独特的亮氨酸/异亮氨酸富集区；同时发现N(△2～15）明显地在细胞核内聚集，研究发现NES位于N末端4和5的两个亮氨酸残基处，并具有独自推动细胞核转出功能。另外，其他麻疹病毒属病毒，麻疹病毒(MV)和牛瘟病毒(RPV)的NLS同样位于N蛋白的N末端70aa～77aa；虽然RPV的NES位置与CDV相同，但是MV的NES则位于N蛋白C末端425aa～440aa。N蛋白除了调节病毒的转录和复制外，还与CDV的毒力密切相关，并且CDV的毒力能够影响CDV对中枢神经系统的持续感染［12］。KeawcharoenJ等［13］从临床分离得到的13株犬瘟热毒株，并将N蛋白的C末端部分基因进行RT-PCR扩增，经序列分析分为两簇，其中A簇的442和171株与Onderstepoort株核苷酸和氨基酸水平上的同源性分别为97.61％和97.30％、99.10％和99.10％，而与其它强毒株核苷酸和氨基酸水平上的同源性较低；B簇的207、577、230、034、418、621、400、468、438、443和466株与其他强毒株核苷酸和氨基酸水平上的同源性为94.63％～99.40％和95.50％～99.10％，而与Onderstepoort株核苷酸和氨基酸水平上的同源性较低。由此可以推断，N蛋白C末端的差异与病毒的毒力有关；也有研究表明，该差异影响病毒的出芽过程和病毒持续感染的产生［12］。2、磷(P)蛋白及其基因磷蛋白(P)基因由1655个核苷酸组成,有两个部分重叠的开放阅读框。首先从P基因的42nt～44nt的AUG，止于1564nt～1566nt，编码507个氨基酸为P蛋白，第2个起始于P基因第65nt～67nt，止于587nt～589nt，编码174个氨基酸为C蛋白。P基因编码三种蛋白，一是具有聚合酶活性的P蛋白，同时还编码两种非结构蛋白V和C。其中在共转录时，在PmRNA中插入一个额外的G残基，产生的mRNA则编码一个非结构V蛋白，该蛋白与P蛋白有着共同的氨基酸端点，但是终止于C末端的70aa［14］。p蛋白分子量为66ku，具有聚合酶活性；V蛋白是必不可少的干扰素颉顽蛋白和细胞因子反应抑制蛋白；C蛋白可能是一种传染性因子［15］。VonMesslingV等［15］通过反向遗传技术构建VknockoutCDV、CknockoutCDV和V、CknockoutCDV重组质粒。经研究表明，V蛋白是病毒在T细胞中迅速增殖所必需的，通过抑制IFN信号传送和IFN转录，进而完全抑制IFN反应和细胞因子；C蛋白可能影响病毒的传染性。RothlisbergerA等［16］，进一步研究表明，V蛋白不仅是干扰素颉颃蛋白，而且V蛋白基因N末端、C末端对于V蛋白抑制IFN-α/β反应的活性是必不可少的。3、基质膜（M）蛋白及其基因基质膜(M)蛋白基因大约由1442个核苷酸组成，3’端有-400个核苷酸的非编码区序列（3’UTR），只有一个开放阅读框，编码335个氨基酸，M蛋白分子质量为34ku，是病毒粒子中最小的蛋白。M蛋白是所有结构蛋白中最为保守的。M蛋白在病毒装配过程中，起到协调病毒组件和膜骨架结构关系的作用。M蛋白还与病毒出芽相关，同时在囊膜糖蛋白与囊膜表面连接中起桥连作用，影响囊膜表面糖蛋白的融合功能［17］。研究表明，病毒复制时需要完整的肌动蛋白纤维［18］。利用激光共聚焦扫描显微镜技术在有无经过La-B、C-D肌动蛋白纤维抑制剂处理的情况下，观察M蛋白在细胞内的分布情况。研究发现M蛋白沿着肌动蛋白纤维对齐成一条线，而肌动蛋白纤维抑制剂能够显著地降低病毒的传染性［19］。经La-B处理后转染Vero细胞，M蛋白主要分布在质膜上，经C-D处理后的M蛋白主要分布在细胞质中，然而F蛋白的分布则没有发现明显地变化，说明肌动蛋白纤维阻断剂特异地影响M蛋白，使其在细胞内的分布发生显著地改变。由此可以推测M蛋白是沿着肌动蛋白纤维运输到质膜，然后完成病毒的出芽过程。这说明M蛋白和肌动蛋白纤维的相互作用可能对产生传染性的CDV至关重要。4、融合(F)蛋白及其基因融合(F)蛋白基因长为2205个核苷酸，F蛋白分子质量为62ku，由F1和F2由两个亚单位蛋白组成，翻译时起始于461～463位的AUG到757位核苷酸，编码99个氨基酸为F2蛋白，分子质量为23ku，从758至2071位核苷酸，编码438个核苷酸为F1蛋白。F1蛋白嵌入囊膜，而F2蛋白位于囊膜外侧，F1蛋白和F2蛋白通过二硫键连接。F蛋白经蛋白酶裂解分为三个部分，缩氨酸信号肽、F2蛋白和F1蛋白［20］。裂解位点AQIHW在缩氨酸信号肽的C端，而RRQRR在F1蛋白的N端［21-23］，这两个裂解位点是高度保守的。缩氨酸信号区在前体蛋白F0被裂解成F1蛋白和F2蛋白的过程中起到至关重要的作用［24］。将Asia1型和Asia2型CDV的缩氨酸信号区分别与Onderstepoort株进行比对，氨基酸差异性分别为30％～32％和34％～35％，核苷酸序列差异性分别为15％～16％和18％～19％，说明该信号肽序列的多样性。F1蛋白具有融合功能，它包括N端的缩氨酸融合区(FP)、穿膜区(TM)和C端的cytoplasmictai区(CT)；F2蛋白具有附着功能。Asia型CDV的F蛋白上有7个潜在的糖基化位点，其中4个分别在F2蛋白区的141位～143、173位～175和179位～181位和F1蛋白区的517位～519位［25］。另外3个潜在糖基化位点具有一致的氨基酸序列(N-X-S/T)，而且只在Asia1型CDV中被发现。其中2个在缩氨酸信号区的62位～64位和108位～110位，最后一个则在个别Asia1型CDVF1蛋白区的605位～607位［26］。F蛋白是位于CDV囊膜上的I型糖蛋白，以非共价键连接的同源三聚体形式存在，介导囊膜和细胞膜融合，使病毒具有在宿主体内扩散的能力，是感染性病毒粒子进入宿主细胞所必需的。VonMessling等［15］构建了3种重组质粒58utrMF-NP、58△F106和58utrMF-NP△F106。研究表明只缺失F蛋白缩氨酸信号(Fsp)区不影响病毒感染的进程和结果；将M-FUTR替换成N-PUTR能够延长病毒在中枢神经系统中的感染进程；缩短M-FUTR能够提高F蛋白转录水平，进而促进F蛋白的翻译和成熟病毒的产生。结果证明，麻疹病毒属病毒M-F基因区通过控制Ｆ基因表达的转录过程来调节病毒的抗原性［27］。5、血凝素(H)蛋白及其基因血凝素(H)蛋