第二章动物细胞工程.

第一节动物细胞培养第二节细胞融合与单克隆抗体第三节细胞核移植与克隆技术第二章动物细胞工程第一节动物细胞培养1.贴附型大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，判断细胞形态时不能按照体内组织学标推判定，大致分成以下四型：一、培养细胞的形态特征（1）成纤维细胞型胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的。来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维细胞，心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮。形态：似体内成纤维细胞的形态。生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片，细胞—细胞接触易断开而单独行动，游离的单独的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起。（2）上皮型细胞细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同。来源：来源于外胚层、内胚层细胞,如：皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡,上皮性肿瘤。形态：类似体内的上皮细胞扁平，不规则多角形，中有圆形核。生长特点：易相连成片，相靠—紧密相连—成薄层—铺石状生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动。（3）游走细胞型呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。（4）多型细胞型有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。Hepatocytes2.悬浮型见于少数特殊的细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长或以机械方法使保持悬浮状态下生长。来源：血，脾或骨髓，尤以血中白细胞，癌肿细胞。特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团。优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)，易于收获，可获得稳定状态。缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)。1.培养细胞生命期（LifeSpanofCultureCells）所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。二、培养细胞的生长和增殖过程（1）原代培养期也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。（2）传代期原代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（CellLine）。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系（DiploidCellLine）。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。（3）衰退期此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（SpontaneousTransformation）。转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（InfiniteCellLine），也称连续细胞系（ContinuousCellLine）。2.组织培养细胞一代生存期所谓细胞“一代”，指从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：（1）潜伏期（LatentPhase）细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。（2）指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数（MitoticIndex：MI）表示。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3-5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（ContactInhibition）。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（DensityInhibition），导致细胞分裂停止。（3）停滞期（StagnatePhase）细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（Plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。三、动物细胞体外培养动物组织器官切碎或酶解原代培养传代培养1.原代培养原代培养是从机体取得材料开始，在培养瓶内培养至第一次传代前的这一过程。主要方法有组织块培养、酶解培养法。2.传代培养原代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。1.肿瘤细胞/细胞系的培养肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。四、特殊组织细胞的培养（1）培养肿瘤细胞生物学特性肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。①形态和性状培养中肿瘤细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。正常上皮极向消失排列紊乱层次增多14～6核∶浆=1∶4～611.1～1.2核∶浆=1∶1.1～1.2间期前期中期后期末期正常细胞的有丝分裂过程恶性肿瘤细胞的病理性核分裂像②生长增殖肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。肿瘤细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。肿瘤细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。肺癌细胞③永生性永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。乳腺癌细胞④浸润性浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。原发瘤血道转移淋巴道转移种植性转移直接蔓延浸润性生长⑤异质性所有肿瘤都是由有增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成。异质性构成同一肿瘤内细胞的活力有差别的瘤组织。正常肠粘膜结肠癌（与正常组织交界）⑥细胞遗传大多数肿瘤细胞有遗传学改变，如失去二倍体核型、呈异倍体或多倍体等。肿瘤细胞群常由多个细胞群组成，有干细胞系和数个亚系，并不断进行着适应性演变。（2）培养方法肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。取材人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。培养基肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的RPMIl640、DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。成纤维细胞的排除成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。抑制成纤维细胞生长因素方法因素组织细胞选择性附着选择性附着底物汇合饲养细胞层选择性培养基胰蛋白酶胶原酶聚丙烯酰胺聚四氟乙烯（Teflon）胶原（猪皮）小鼠3T3人胎小肠D-缬氨酸（Valine）MCDB-710MCDB-153Phenobarbitone胚胎小肠、心肌、表皮乳癌各种肿瘤转化细胞表皮细胞表皮正常和恶性乳腺上皮结肠癌肾组织乳腺表皮肝细胞成纤维细胞排除法机械刮除法：标记→刮除→冲洗→培养反复贴壁法：根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。胶原酶消化法：本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。【形态观察】主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。【细胞生长增殖】检测细胞生长曲线、细胞分裂指数、倍增时间、细胞周期时间。【细胞核型分析】检测核型特点，染色体数量、标记染色体的有无、带型等。【凝集试验】检测凝集力。【软琼脂培养】检测集落形成能力。【异体动物接种】向异体动物体内（皮下）接种细胞悬液，观察成瘤能力。【其它】除上述项目外，根据需要还可做同位素标记、组织化学成分分析，荧光显微镜观察等。体外培养肿瘤细胞生物学检测2.上皮细胞培养上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能利于生长。子宫内膜上皮细胞3.神经胶质细胞培养神经细胞（神经元〕不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。4.巨噬细胞培养巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。巨噬细胞也建有无限细胞系。肺巨噬细胞吞噬大肠杆菌TheNIH/3T3,acontinuouscelllineofhighlycontact-inhibitedcellswasestablishedfromNIHSwissmouseembryoculturesinthesamemannerastheoriginalrandombred3T3andtheinbredBALB/c3T3.NIH／3T3五、一些重要的细胞系ThislinewasderivedfromtheCV-1cellline(ATCCCCL-70)bytransformationwithanorigindefectivemutantofSV40whichcodesforwild-typeTantigen.COS-7TheVerocelllinewasinitiatedfromthekidneyofanormaladultAfricangreenmonkeyonMarch27,1962,byY.YasumuraandY.KawakitaattheChibaUniversityinChiba,Japan.VerocellEL4wasestablishedfromalymphomainducedinaC57BLmouseby9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene.EL4淋巴瘤细胞HL-60isapromyelocyticcelllinederivedbyS.J.Collins,etal.Peripheralbloodleukocyteswereobtainedbyleukopheresisfroma36-year-oldCaucasianfemalewithacute