脱细胞猪角膜基质支架的制备及其生物相容性

中国组织工程研究第20卷第30期2016–07–15出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchJuly15,2016Vol.20,No.30ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4449·研究原著·霍银平，女，1977年生，汉族，河南省开封市人，2007年郑州大学毕业，硕士，主治医师，主要从事眼底病白内障及眼表疾病研究。通讯作者：周利晓，博士，主任医师，郑州大学第五附属医院眼科，河南省郑州市450052中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)30-04449-07稿件接受：2016-04-27脱细胞猪角膜基质支架的制备及其生物相容性霍银平，周利晓，孙成林(郑州大学第五附属医院眼科，河南省郑州市450052)引用本文：霍银平，周利晓，孙成林.脱细胞猪角膜基质支架的制备及其生物相容性[J].中国组织工程研究，2016，20(30):4449-4455.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.30.006ORCID:0000-0002-8330-4397(周利晓)文章快速阅读：文题释义：脱细胞角膜基质：角膜基质经脱细胞处理后，角膜上皮细胞被完全除去，胶原层变松散，基质内有少量残留细胞，经多次冻融后胶原层恢复原来结构，基质中残留细胞被除去，有微量核物质残留，经DNA-RNA酶处理后，残留核物质被除去，风干后角膜结构完整，胶原纤维排列整齐。组织工程角膜载体支架材料：由于胶原、壳聚糖、纤维蛋白、透明质酸等载体支架均存在一定的局限性，和天然的角膜成分和结构存在差异，在临床应用中有一定限制。脱细胞角膜基质的成分和结构和天然的角膜比较相似，含有多种细胞因子，免疫原性比较低，可塑性比较好，机械强度比较好，是一种比较理想的组织工程角膜载体支架材料。摘要背景：研究发现多种生物材料可制备角膜基质支架且具有良好的生物相容性，而关于脱细胞猪角膜基质支架的制备和生物相容性研究不多。目的：制备脱细胞猪角膜基质支架，探讨其与人角膜基质细胞的生物相容性。方法：制备脱细胞猪角膜基质支架及其浸提液。取生长状态良好的人角膜基质细胞，分别以脱细胞猪角膜基质支架浸提液(实验组)、完全培养基培养(对照组)培养，培养后1，2，3d，采用MTT法检测人角膜基质细胞的增殖；将人角膜基质细胞直接接种于脱细胞猪角膜基质支架上，接种1，3，7d，采用免疫化学法测定人角膜基质细胞在支架内的生长情况。结果与结论：①随着时间的增加，实验组与对照组人角膜基质细胞数量不断增加，两组不同时间点的吸光度值比较差异无显著性意义；②人角膜基质细胞在脱细胞猪角膜基质支架上生长良好，细胞整联蛋白β1、波形蛋白、乙醛脱氢酶3A1呈阳性表达，CD34、CDK2和K-Ras蛋白也呈阳性表达；③结果表明，脱细胞猪角膜基质支架无细胞毒性，与人角膜基质细胞具有良好的生物相容性。关键词：生物材料；材料相容性；脱细胞猪角膜基质支架；生物相容性；人角膜基质细胞；整联蛋白β1；波形蛋白，乙醛脱氢酶3A1主题词：生物相容性材料；角膜基质；组织工程基金资助：河南省医学科技攻关计划项目(201503131)脱细胞猪角膜基质支架的生物相容性利用猪眼球制备脱细胞猪角膜基质支架及其浸提液取人角膜基质细胞，将其复苏取生长状态良好的人角膜基质细胞，分别以脱细胞猪角膜基质支架浸提液(实验组)、完全培养基培养(对照组)培养；将人角膜基质细胞直接接种于脱细胞猪角膜基质支架上培养后1，2，3d，MTT法检测材料浸提液对人角膜基质细胞增殖的的影响接种1，3，7d，免疫化学法测定人角膜基质细胞在支架内的生长情况。霍银平，等.脱细胞猪角膜基质支架的制备及其生物相容性P.O.Box10002,Shenyang110180:ZhouLi-xiao,M.D.,Chiefphysician,DepartmentofOphthalmology,theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,HenanProvince,ChinaPreparationofanacellularporcinecornealstromascaffoldanditsbiocompatibilityHuoYin-ping,ZhouLi-xiao,SunCheng-lin(DepartmentofOphthalmology,theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,HenanProvince,China)AbstractBACKGROUND:Studieshavefoundthatavarietyofbiologicalmaterialscanbeusedforpreparingcornealstromascaffoldsthathavegoodbiocompatibility,butresearchonpreparationandbiocompatibilityoftheacellularporcinecornealstromascaffoldislittle.OBJECTIVE:Toexplorethepreparationandbiocompatibilityoftheacellularporcinecornealstromascaffold.METHODS:Acellularporcinecornealstromascaffoldanditsextractwereprepared.Well-grownhumancornealstromalcellswereselectedandculturedintheextractofacellularporcinecornealstromascaffold(experimentalgroup)orinthecompletemedium(controlgroup),respectively.After1,2and3daysofculture,theproliferationabilityofhumancornealstromalcellswasdetectedbyMTTassay.Inthemeanwhile,humancornealcellsweredirectlyseededontotheacellularporcinecornealstromascaffold,andthenthecellgrowthonthescaffoldwasdetectedusingimmunochemicalmethod.RESULTSANDCONCLUSION:Thenumberofhumancornealstromalcellswasinarisewithtimeinthetwogroups,andabsorbancevalueshadnosignificantdifferencebetweentwogroupsatdifferenttimepointsofculture.Humancornealstromalcellsgrewwellonthescaffold,andwerepositiveforcellintegrinβ1,vimentin,aldehydedehydrogenase3A1,aswellasCD34,CDK2andK-Ras.Theseresultsshowthattheacellularporcinecornealstromascaffoldhasnocytotoxicity,andhasgoodbiocompatibility.Subjectheadings:BiocompatibleMaterials;CornealStroma;TissueEngineeringFunding:theMedicalScienceandTechnologyResearchProjectofHenan,No.201503131Citethisarticle:HuoYP,ZhouLX,SunCL.Preparationofanacellularporcinecornealstromascaffoldanditsbiocompatibility.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(30):4449-4455.0引言Introduction角膜是眼球最前端的一层薄膜，为眼睛提供屈光力，呈横椭圆形。角膜从内到外分为内皮层、后弹力层、基质层、前弹力层和上皮层，基质层含有大量胶原纤维板，占角膜厚度的90%，角膜基质细胞位于胶原纤维之间，维持角膜的透明性。角膜疾病是第2位的致盲原因，大多数为角膜基质缺损。对于角膜盲，角膜移植是惟一有效的方法[1-3]，但角膜移植供体供体比较缺乏，使其在临床应用中受到限制[3]，研发有效的角膜代替品是解决角膜供体不足的重要方法。随着组织工程技术的不断发展，使获得具有生物活性的角膜呈为可能，组织工程角膜有可能成为角膜基质供体的有效代替物[4-6]。支架材料能够为细胞提供结构上的支撑作用，还可作为模板控制组织的结构和诱导组织的再生，具有顶形状结构和良好生物相容性的支架材料，是组织工程角膜成功的主要因素[7-10]。实验制备脱细胞猪角膜基质支架，研究脱细胞猪角膜基质支架材料和人角膜基质细胞的生物相容性。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计观察性实验。1.2时间及地点实验于2014年6月至2015年12月在郑州大学第五附属医院实验室完成。1.3材料新鲜猪眼球购自青岛康宏利食品有限公司。人角膜基质细胞由郑州大学第五附属医院研究室提供，非转染、无致瘤性。1.4实验方法脱细胞猪角膜基质支架的制备：将新鲜猪眼球用含抗生素的PBS充分洗涤，手术显微镜下切取约1/2厚的前板层角膜，三蒸水漂洗后，37℃下置于2.5g/L胰酶中消化30min(反复震荡)，三蒸水震荡漂洗，放入-196℃液氮中快速冷冻15min，取出后37℃水浴快速复温解冻，上述冻融过程重复3次，然后置于DNA-RNA酶中消化(667μkat/L)1h，三蒸水震荡漂洗，将材料置于低温冰箱(-80℃)预冻，转入冷冻干燥机中，真空干燥，持续16h左右。将冻干的角膜基质材料密封于无菌塑料包装袋中，60Co消毒，保存备用。脱细胞猪角膜基质支架的苏木精-伊红染色：将风干的脱细胞猪角膜基质用甲醛固定，乙醇脱水，石蜡包埋，切成5µm厚切片，进行苏木精-伊红染色：将切片脱腊水化，苏木精和伊红染色，显微镜下观察脱细胞猪角膜基质支架的组织结构变化。霍银平，等.脱细胞猪角膜基质支架的制备及其生物相容性ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH4451人角膜基质细胞的复苏和培养：将液氮罐内的人角膜基质细胞置入水浴中融化，移至离心管内离心，得到复苏的人角膜基质细胞，加入DMEM/F12培养液悬浮细胞，离心，加入DMEM/F12培养液重悬细胞，接种到培养瓶中进行培养，24h进行换液，待人角膜基质细胞形成单层细胞，基本铺满瓶底时进行传代培养，将人角膜基质细胞接种到含胎牛血清的DMEM/F12培养液中，人角膜基质细胞长满瓶底时移除原培养液，PBS漂洗，胰蛋白酶进行消化，再加入DMEM/F12培养液进行传代培养。人角膜基质细胞的鉴定：取生长良好的人角膜基质细胞，胰蛋白酶消化，接种到细胞培养板